Perpustakaan Digital ITB

Sebagian besar dari intisel mengandung material genetik yang dibutuhkan oleh sel. Intisel dikelilingi oleh selaput intisel yang terdiri atas dua membrane yaitu membrane bagian dalam dan membran bagian luar. Ribuan molekul yang berbeda ditransportasikan ke dalam dan ke luar intisel. Transportasi tersebut diatur oleh protein berukuran besar yang terletak di selaput intisel, yaitu pori-pori intisel. Mekanime pengangkutan soluble protein telah dipelajari dengan seksama dan proses transportasi tersebut membutuhkan suatu urutan asam amino di dalam tubuh protein tersebut, nuclear localization signal (NLS). Sinyal ini berfungsi sebagai kode molekul. Seperti halnya soluble protein, transportasi protein membran menuju membran bagian dalam intisel juga membutuhkan NLS. Berdasarkan riset sebelumnya, transportasi tersebut tidak hanya membutuhkan sinyal saja melainkan fitur atau struktur dari protein menbran tersebut. Hal ini dibuktikan dengan tidak adanya import ke dalam membrane dalam dari protein Heh2 yang diperpendek daerah antara sequence NLS dan transmembran domain maupun pengantian sequence di daerah antara sequence NLS dan transmembran domain. Oleh karena itu, tujuan dari riset ini adalah untuk menentukan struktur dari NLS domain protein integral Heh2. Tujuan utama dilakukan riset ini adalah untuk mengetahui mekanisme dari protein membran dalam karena beberapa protein membrane dalam telah diketahui berhubungan dengan beberapa penyakit genetik. Pemahaman akan mekanisme transportasi dari protein membrane dalam ini diharapkan dapat membantu untuk mengetahui mekanine dari penyakit tersebut. Gen NLS domain Heh2, dari ragi dikloning ke dalam plasmid E. coli strain MC 1061, pBAD, yang mengandung poly-histidine10 dengan menggunakan metode Ligation Independent Cloning (LIC). Pemurnian dilakukan menggunakan teknik kromatografi yaitu Immobilization Metal Affinity Chromatography (IMAC) and Size Exclusion Chromatography (SEC). Sayangnya, selama proses pemurnian NLS domain menunjukkan profil yang tidak ideal diantaranya massa molekul yang diperoleh lebih besar daripada massa molekul teori, (17kDa). Selain itu, protein tersebut membentuk oligomer atau agregat di dalam gel filtrasi tetapi hal tersebut tidak teramati pada native gel. Diduga hal tersebut disebabkan oleh folding yang kurang sempurna. Meskipun demikian, ketika protein tersebut digabungkan dengan Green Flourescent Protein (GFP) dan diekspresikan didalam sel ragi, protein yang dihasilkan memiliki profil yang bagus meski massa molekulnya juga bertambah (12 kDa extra). Analisis menggunakan western blot dan MALDI menunjukkan adanya modifikasi, sumoylasi. Pengukuran GFP-NLS domain menggunakan confocal mikroskop menunjukkan akumulasi fluorescent yang sangat tinggi di nucleus, 20 kali lipat lebih tinggi daripada GFP-cNLS. Secara struktural, kemungkinan NLS yang digabung dengan GFP memiliki kestabilan yang lebih baik daripada gabungan dengan poli-histidin. Hasil ini dapat digunakan sebagai assay biokimia seperti pengukuran transport di inti sel.