Perpustakaan Digital ITB

Pankreatin merupakan suatu bahan yang mengandung beberapa enzim pencernaan terutama amilase, lipase dan protease yang diperoleh dari pancreas binatang mamalia seperti sapi dan babi. Dalam bidang farmasi, pankreatin digunakan sebagai agen oral untuk pancreatic enzyme-replacement therapy (PERT) untuk pasien yang mengalami pancreatic exocrine insufficiency (PEI). Dalam FI ed VI 2020, pakreatin yang digunakan berasal dari pankreas sapi jantan Bos taurus. Pankreatin sebagai bahan baku obat harus berkualitas dan memenuhi parameter mutu tertentu. Salah satu parameter mutu tersebut adalah terkait aktivitas protease pankreatin. Dalam FI ed VI 2020, substrat yang digunakan dalam penetapan aktivitas enzim protease adalah kasein. Namun dalam prakteknya penggunaan kasein mengalami kelemahan seperti sukar larut di air, proses analisis multi tahap dan waktu analisis yang lama. Beberapa substrat telah digunakan untuk menggantikan kasein seperti azokasein, gelatin dan hemoglobin. Dalam penelitian ini kandidat substrat yang digunakan adalah c-fikosianin (CPC) yang berasal dari Spirulina platensis. Penelitian ini bertujuan untuk isolasi, karakterisasi, studi interaksi CPC dengan pankreatin, studi kinetika enzim dan aplikasi CPC sebagai substrat pada penetapan aktivitas protease pankreatin. Penelitian meliputi isolasi, pemurnian dan karakterisasi CPC, interaksi CPC dengan pankreatin, penentuan hubungan antara laju reaksi awal dengan aktivitas protease, uji kinetika enzim protease, pengembangan dan validasi metode. Isolasi menggunakan kombinasi metode homogenisasi dengan mortar dan alu, sonikasi pada amplitude 40% selama 5 menit, sentrifugasi pada 2500 rcf selama 15 menit dan filtrasi menggunakan kertas saring. CPC yang dihasilkan kemudian dimurnikan dengan metode aqueous two phase system (ATPS) dengan sistem PEG 6000 10 %b/v dan dapar kalium fosfat 1 M, pH 7,2 dan dialisis dengan membran selulosa dengan cut off 12 kDa - 14 kDa. Larutan hasil isolasi dikarakterisasi dengan penentuan kadar protein, kadar dan kemurnian CPC pada panjang gelombang 620 nm dan 652 nm, spektrum UV-Vis, spektrum eksitasi dan spektrum emisi. Uji kinetika dilakukan dengan menentukan hubungan antara laju reaksi awal dengan aktivitas protease, penentuan laju maksimum (Vmaks) dan Km menurut persamaan Michaelis Menten dan Lineweaver-Burk. Validasi metode meliputi akurasi, presisi, linieritas, batas deteksi, dan batas kuantisasi. Dari hasil isolasi diperoleh 2 fraksi CPC yaitu fraksi hasil ATPS tanpa dialisis (FATPS-ND) dan fraksi ATPS dengan dialisis (FATPS-D) dengan kadar protein, kadar CPC dan kemurnian CPC berturut 63,7 ± 1,31 mg/100 mL, 12,6 ± 0,13 mg/100 mL dan 0,51 ± 0,002 (FATPS-ND); 33,3 ± 0,60 mg/100 mL, 9,4 ± 0,13 mg/100 mL dan 0,85 ± 0,002 (FATPS-D). Hasil karakterisasi spektrum UV-Vis, spektrum eksitasi dan emisi kedua fraksi tersebut menunjukkan bahwa fraksi tersebut adalah CPC dengan ?maks 620 nm, ?maks eksitasi 620 nm dan ?maks emisi 647 nm. Hasil interaksi CPC dengan pankreatin menunjukkan terjadi pengurangan konsentrasi CPC dalam waktu inkubasi yang digunakan. Hubungan laju reaksi awal (vo) dengan aktivitas protease (5–30 IU/mL) menunjukkan kurva yang linear, khususnya pada waktu inkubasi 5 -30 menit dengan R2 > 0,9. Studi kinetika enzim menunjukkan untuk Vmaks pada waktu inkubasi reaksi 10, 20, 30 menit berturut-turut adalah 2,59; 1,47; 1,47 ?g/mL/menit dan untuk Km pada waktu inkubasi yang sama berturut-turut adalah 91,66; 70,86; 79,22 ?g/mL. Nilainilai parameter ini digunakan untuk memprediksi kurva hiperbola MichaelisMenten. Hasil uji spesifisitas/selektivitas yang menggunakan FATPS-D menunjukkan matriks tidak mengganggu penetapan aktivitas protease. Hal ini terlihat dari derajat penyimpangan (%bias) yang masih dibawah 5 % dan hasil akurasi metode yang mendekati 100%. Hasil uji linieritas pada rentang aktivitas protease (30 – 80 IU/mL) untuk kedua fraksi menunjukkan hubungan yang linier antara Vo dengan aktivitas protease, yang ditandai dengan nilai R2 >0,99. Selain itu, hasil perhitungan koefisien variasi dari fungi (Vx0) menunjukkan nilai masing-masing yaitu 3,57% untuk FATPS-D dan 3,01 untuk FATPS-ND. Sedangkan batas deteksi dan batas kuantisasi metode berturut-turut yaitu 4,99 dan 16,64 IU/mL untuk FATPS-ND; dan 5,93 dan 19,76 IU/mL untuk FATPS-D. Hasil akurasi metode menunjukkan bahwa persen perolehan kembali pada tingkat kandungan pankreatin 80%, 100% dan 120% berturut-turut 113,4 ± 4,62; 108,5 ± 8,48 dan 111,0 ± 6,38% untuk FATPS-ND; dan 104,1 ± 2,15; 99,9 ± 3,94 dan 101,3 ± 3,37% untuk FATPS-D. Hasil presisi metode pada hari pertama dan kedua menunjukan koefisian variasi (CV) berturut-turut 7,8% dan 3,8% untuk FATPSND dan 3,9% dan 3,3% untuk FATPS-D. Aplikasi metode pada sampel perdagangan menunjukkan aktivitas protease sebesar 17044,3 ± 472,25 IU/kaplet untuk FATPS-D dan 19587,7 ± 288,65 IU/kaplet untuk FATPS-ND. Sebagai kesimpulan, CPC dapat digunakan sebagai kandidat substrat baru untuk penetapan aktivitas protease pankreatin dengan keunggulan yaitu prosedur lebih sederhana dan pereaksi lebih sedikit sehingga waktu analisis lebih cepat.