Artikel Terbaru

PRODUKSI, PURIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS DNA POLIMERASE THERMUS AQUATICUS PADA ESCHERICHIA COLI BL21-CODONPLUS(DE3)-RIPL

Oleh   Fitria Puspawati [20719010]
Kontributor / Dosen Pembimbing : Dr. apt. Aluicia Anita Artarini, S.Si., M.Sc.,;Dr.rer.nat. Catur Riani, S.Si., M.Si.;
Jenis Koleksi : S2 - Tesis
Penerbit : SF - Farmasi
Fakultas : Sekolah Farmasi (SF)
Subjek :
Kata Kunci : DNA pol Taq, E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL, PCR, qPCR, inhibitor PCR.
Sumber :
Staf Input/Edit : yana mulyana  
File : 1 file
Tanggal Input : 2021-06-24 04:02:18

DNA polimerase (DNA pol) merupakan enzim yang digunakan untuk mengkatalisis reaksi sintesis DNA. DNA pol telah dimanfaatkan secara luas dan memiliki peranan penting dalam bidang bioteknologi sebagai komponen enzim pada Polymerase Chain Reaction (PCR) dan PCR kuantitatif (qPCR). DNA polimerase Thermus aquaticus (DNA pol Taq) yang digunakan dalam PCR merupakan enzim termostabil dengan aktivitas polimerase dan eksonuklease 5’?3’. Penggunaan DNA pol Taq cukup tinggi di Indonesia, tetapi sebagai produk impor. Tujuan penelitian ini adalah melakukan overproduksi, purifikasi dan uji aktivitas polimerase DNA pol Taq. Konstruksi urutan DNA sintetik DNA pol Taq dilakukan dengan substitusi asam amino E626K, I707L, dan E708N yang memiliki karakteristik resisten terhadap inhibitor PCR. Kerangka baca terbuka pengkode DNA pol Taq disintesis dan di sisipkan pada vektor ekspresi pET28a dan pET28a_DNA pol Taq ditransformasi ke dalam Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL. Hasil overproduksi menunjukkan kondisi optimal pada IPTG dengan konsentrasi akhir 0,1 mM selama 18 jam pada 37°C dengan protein terlarut 64,23%. Protein murni lebih banyak diperoleh dari hasil produksi pada 37°C dengan konsentrasi imidazol pada larutan pengelusi sebesar 250 dan 500 mM menggunakan resin Ni-NTA. Enzim DNA pol Taq mampu mengamplifikasi produk PCR hingga 3.708 pb. DNA pol Taq juga dapat digunakan untuk deteksi molekular dengan metode qPCR dan RT-qPCR. Aktivitas spesifik DNA pol Taq adalah sebesar 25.000 U/mg. Karakterisasi kinerja DNA pol Taq terhadap inhibitor PCR menunjukkan resistensi terhadap SDS hingga konsentrasi 0,1%, guanidin HCl hingga konsentrasi 100 mM, plasma hingga konsentrasi 8%, darah hingga konsentrasi 4% dan VTM hingga konsentrasi 30%. Dengan demikian, DNA pol Taq dapat diproduksi dalam bentuk aktif menggunakan pET28a_DNA pol Taq di E. coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL serta resisten terhadap inhibitor yang diuji.