ABSTRAK Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana COVER Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana BAB 1 Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana BAB 2 Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana BAB 3 Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana BAB 4 Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana BAB 5 Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana BAB 6 Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana PUSTAKA Fitria Puspawati
PUBLIC yana mulyana
DNA polimerase (DNA pol) merupakan enzim yang digunakan untuk mengkatalisis
reaksi sintesis DNA. DNA pol telah dimanfaatkan secara luas dan memiliki peranan
penting dalam bidang bioteknologi sebagai komponen enzim pada Polymerase
Chain Reaction (PCR) dan PCR kuantitatif (qPCR). DNA polimerase Thermus
aquaticus (DNA pol Taq) yang digunakan dalam PCR merupakan enzim termostabil
dengan aktivitas polimerase dan eksonuklease 5’?3’. Penggunaan DNA pol Taq
cukup tinggi di Indonesia, tetapi sebagai produk impor. Tujuan penelitian ini adalah
melakukan overproduksi, purifikasi dan uji aktivitas polimerase DNA pol Taq.
Konstruksi urutan DNA sintetik DNA pol Taq dilakukan dengan substitusi asam
amino E626K, I707L, dan E708N yang memiliki karakteristik resisten terhadap
inhibitor PCR. Kerangka baca terbuka pengkode DNA pol Taq disintesis dan di
sisipkan pada vektor ekspresi pET28a dan pET28a_DNA pol Taq ditransformasi ke
dalam Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL. Hasil overproduksi
menunjukkan kondisi optimal pada IPTG dengan konsentrasi akhir 0,1 mM selama
18 jam pada 37°C dengan protein terlarut 64,23%. Protein murni lebih banyak
diperoleh dari hasil produksi pada 37°C dengan konsentrasi imidazol pada larutan
pengelusi sebesar 250 dan 500 mM menggunakan resin Ni-NTA. Enzim DNA pol
Taq mampu mengamplifikasi produk PCR hingga 3.708 pb. DNA pol Taq juga dapat
digunakan untuk deteksi molekular dengan metode qPCR dan RT-qPCR. Aktivitas
spesifik DNA pol Taq adalah sebesar 25.000 U/mg. Karakterisasi kinerja DNA pol
Taq terhadap inhibitor PCR menunjukkan resistensi terhadap SDS hingga
konsentrasi 0,1%, guanidin HCl hingga konsentrasi 100 mM, plasma hingga
konsentrasi 8%, darah hingga konsentrasi 4% dan VTM hingga konsentrasi 30%.
Dengan demikian, DNA pol Taq dapat diproduksi dalam bentuk aktif menggunakan
pET28a_DNA pol Taq di E. coli BL21-Codon Plus(DE3)-RIPL serta resisten
terhadap inhibitor yang diuji.