Perpustakaan Digital ITB

Enzim reverse transciptase (RT) merupakan enzim yang dapat membentuk sekuens cDNA dari template RNA. Enzim ini banyak digunakan dalam pengembangan tes diagnostik maupun dalam penelitian dasar. Namun, enzim tersebut, secara khusus RT dari Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV), diketahui memiliki kekurangan pada termostabilitas, kemampuan sintesis (prosesivitas), dan mudah terganggu oleh inhibitor–berhubungan dengan prosesivitas. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dirancang secara in silico fusi protein enzim MMLV RT yang dapat meningkatkan afinitas enzim tersebut terhadap ligannya. Afinitas diketahui berhubungan dengan termostabilitas dan prosesivitas. Selanjutnya, hasil rancangan akan dikonstruksi dalam suatu vektor sehingga diharakan dapat diekspresikan dalam rekombinan Escherichia coli. Dalam penelitian ini, protein native MMLV (PDB 4MH8) akan difusikan secara in silico dengan 3 jenis protein dari keluarga 7-kDa-DNA-binding Archaea, yaitu protein Sto7, Aho7c dan Sis7a. Kemudian, dirancang kombinasi protein fusi dengan atau tanpa linker (GGVDMI dan GGGGS), serta kombinasi fusi pada ujung C dan ujung N. Selanjutnya, kombinasi protein fusi ini akan diprediksi model struktur 3D-nya menggunakan website trRosetta dan refinement menggunakan GalaxyRefine. Penilaian struktur 3D akan dilakukan menggunakan MolProbity, ProSA, dan SAVESv6.0. Selanjutnya, energi bebas molekul dianalisis menggunakan FoldX. Analisis molecular docking dilakukan menggunakan HADDOCK dan energi afinitas ligan dianalisis menggunakan PreDBA. Analisis karakteristik fisikokimia protein dilakukan menggunakan ExPASy ProtParam. Konstruksi plasmid berisi enzim terpilih dilakukan secara in silico menggunakan pET-23a(+) sebagai plasmid backbone. Melalui penelitian ini diketahui bahwa, kombinasi fusi Sis7a pada ujung C dari MMLV RT dengan menggunakan linker GGVDMI, memiliki struktur 3D, molecular docking, dan afinitas yang paling baik. Melalui hasil analisis strukur 3D, didapatkan nilai Ramachandran favored sebesar 97,6%, ERRAT-score sebesar 88,09%, Z-score di dalam rentang NMR, dan local model quality memiliki energi rendah. Selanjutnya, analisis energi bebas menunjukkan bahwa enzim fusi membutuhkan energi yang cukup rendah yaitu 9.5 kkal/mol untuk pelipatan jika dibandingkan dengan kontrol enzim native. Menurut analisis energi afinitas ligan, enzim dapat berikatan secara spontan dengan ligan nukleotida dengan energi -6.5 kkal/mol dan memiliki peningkatan energi afinitas dibandingkan enzim native. Melalui analisis molecular docking, diketahui enzim fusi memiliki interaksi pada residu Lys397, Lys398, Thr306, Arg298, dan Glu302, serta berinteraksi pada domain finger, palm, thumb, dan connection sesuai dengan residu aktif enzim native. Hasil analisis karakteristik fisikokimia protein menunjukkan bahwa protein bersifat stabil, termostabil, dan hidrofilik. Analisis sekuens DNA dari enzim fusi menunjukkan nilai CAI 0.87 dan konten GC bernilai 55.75%. Sekuens nukelotida dari enzim fusi tersebut berhasil dikonstruksi pada plasmid pET-23a(+). Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa pada penelitian ini telah berhasil dirancang protein fusi enzim MMLV RT. Hasil analisis in silico menunjukkan bahwa enzim fusi tersebut memiliki afinitas yang lebih tinggi terhadap ligan dan diprediksi dapat diekspresikan dalam sistem bakteri rekombinan. Penelitian lebih lanjut dibutuhkan untuk mengkonfirmasi hasil perancangan in silico tersebut.