Article Details

PENGEMBANGAN METODE QPCR UNTUK KUANTIFIKASI SISA DNA INANG OGATEA POLYMORPHA STRAIN R

Oleh   Dwi Elfira Kurniati [20718011]
Kontributor / Dosen Pembimbing : Dr.rer.nat. Catur Riani, S.Si., M.Si.;;
Jenis Koleksi : S2 - Tesis
Penerbit : SF - Farmasi
Fakultas : Sekolah Farmasi (SF)
Subjek :
Kata Kunci : qPCR, sisa DNA Inang, Ogatea. polymorpha strain R, spesifisitas primer
Sumber :
Staf Input/Edit : yana mulyana  
File : 1 file
Tanggal Input : 2021-02-02 10:00:24

Kuantifikasi sisa DNA inang penting dilakukan untuk menjamin keamanan dan kualitas produk vaksin. WHO mensyaratkan jumlah sisa DNA inang pada produk vaksin rekombinan yang diproduksi di sel ragi kurang dari 10 pg per dosis. PT. B mengembangkan produk vaksin subunit HBsAg yang diekspresi di sel ragi Ogatea polymorpha strain R. Pada uji pendahuluan ditemukan bahwa kit komersial untuk penentuan jumlah sisa DNA inang tidak sesuai untuk sel inang O. polymorpha strain R. Pengembangan metode qPCR bertujuan untuk menghasilkan sistem kuantifikasi mandiri yang spesifik dan tervalidasi agar selanjutnya dapat digunakan untuk kuantifikasi sisa DNA O. polymorpha strain R. Sebelumnya telah dirancang primer yang mentarget daerah X, Y, dan Z pada genom O. polymorpha strain R dan telah dibuktikan spesifisitas primer dengan PCR konvensional. Tujuan yang ingin dicapai pada penelitian ini adalah menyiapkan DNA standar untuk digunakan pada tahap kuantifikasi dan penentuan spesifisitas primer melalui qPCR berbasis SYBR Green dan qPCR Taqman. Standar DNA genom O. polymorpha strain R dibuat dengan konsentrasi 30 ng/┬ÁL dan memberikan nilai SD+2, SD+3, SD-2 dan SD-3 berturut-turut sebesar 31,54; 32,25; 28,71; dan 28,00 pada uji pengulangan 3 waktu berbeda. Rasio kemurnian 260/280 standar DNA sebesar 1,936 + 0,058 memenuhi kriteria penerimaan yang disyaratkan oleh ISO yaitu 1,8-2,0. Sedangkan rasio kemurnian 260/230 standar DNA sebesar 1,651 + 0,052, di bawah kriteria penerimaan yang disyaratkan oleh ISO yaitu 2,0-2,2. Uji spesifisitas terhadap primer X, Y dan Z menghasilkan nilai Ct 11,88; 11,85; dan 11,93 ketika menggunakan DNA cetakan O. polymorpha strain R 3000 pg dan menghasilkan puncak tunggal pada kurva pelelehan ketika diuji menggunakan qPCR berbasis SYBR Green. Uji spesifisitas menggunakan qPCR Taqman dibandingkan dengan DNA non-target yaitu Pichia pastoris 3000 pg. Nilai Ct primer X, Y, dan Z adalah 15,57; 16,14; dan 15,29, sedangkan sampel non-target memiliki nilai Ct > 28 . Hal ini menunjukkan semua pasangan primer terbukti mampu mengamplifikasi target secara spesifik menggunakan metode qPCR berbasis SYBR Green maupun metode qPCR Taqman.