Perpustakaan Digital ITB

Protein rekombinan intraselular pada sistem ekspresi Escherichia coli seringkali memberikan produk protein dalam bentuk badan inklusi. Badan inklusi dapat dikurangi dengan menargetkan protein rekombinan ke ruang periplasma. Protein rekombinan dapat ditargetkan ke ruang periplasma menggunakan sistem Twin-Arginine Translocation (TAT) AdCd Bacillus subtilis. Pada penelitian ini, daerah pengkode tatAd dan tatCd diisolasi dari Bacillus subtilis ATCC 6633 menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Daerah pengkode tatAdCd hasil penelitian ini nantinya akan dikloning ke vektor ekspresi dan diharapkan dapat membantu dalam proses penghantaran protein rekombinan target ke periplasma di penelitian selanjutnya. Sebelum isolasi tatAd dan tatCd dilakukan, diperlukan proses perancangan primer secara in silico. Perancangan primer ditujukan untuk produksi tatAd dan tatCd secara polisistronik menggunakan Ribosome Binding Site (RBS) alami tatAdCd dan RBS hasil rancangan primer yang telah dioptimasi. Untuk itu dihasilkan empat primer. Primer hasil rancangan dianalisa secara in silico terkait spesifisitas penempelan, pembentukan self dimer, pair dimer, dan hairpin formation. Selain itu juga dilakukan kajian in silico kecepatan inisiasi translasi tatCd. Isolasi daerah pengkode tatAd dan tatCd dengan PCR dilakukan pada dua tabung terpisah. Daerah pengkode tatAd dan tatCd hasil PCR kemudian dimurnikan dengan ekstraksi gel. Setelah dimurnikan, tatAd dan tatCd di PCR kembali dalam satu tabung reaksi sehingga didapatkan fragmen tatAdCd dengan RBS teroptimasi. Isolasi tatAd, tatCd, dan tatAdCd dilakukan pada kondisi pre-denaturasi awal (94?C, 5 menit), denaturasi (94?C, 30 detik), penempelan primer (45 detik dengan suhu 58?C untuk tatAd dan tatAdCd; 54?C untuk tatCd), dan elongasi (68?C, 45 detik). Proses PCR dilakukan sebanyak 25 siklus menggunakan KOD polimerase dan diakhiri dengan proses elongasi akhir pada 68?C selama 3 menit. Produk hasil PCR tatAd, tatCd, dan tatAdCd dikonfirmasi menggunakan elektroforesis DNA dengan gel agarosa 1%, pada 80V, 400mA, selama 60 menit. Hasil elektroforesis DNA menunjukkan bahwa daerah pengkode tatAd, tatCd, dan tatAdCd dengan RBS hasil perancangan primer berhasil diisolasi dengan ukuran secara berturut-turut yaitu 251, 768, dan 1034 pb.