Perpustakaan Digital ITB

Vitamin adalah senyawa yang berperan penting dalam proses biologis dalam sel. Walaupun esensial untuk makhluk hidup, vitamin hanya dapat disintesis secara de novo oleh mikroorganisme, serta beberapa jenis tumbuhan dan fungi. Impor vitamin dari lingkungan lebih disukai karena sintesis vitamin membutuhkan energi dalam jumlah tinggi. Sebagai contoh, sintesis satu molekul biotin membutuhkan setidaknya 6 enzim dan 7 ekivalen ATP. Escherichia coli diketahui dapat mentranspor biotin walaupun tidak memiliki gen yang mengkode BioMNY. BioMNY adalah protein transporter biotin yang umumnnya dimiliki oleh prokariot. Analisis genomik E. coli menunjukkan bahwa yigM merupakan gen yang berpotensi mengkode BioMNY di E. coli. YigM terdiri atas 299 asam amino dengan berat molekul ~33 kDa. YigM tidak memiliki kemiripan urutan asam amino dengan biotin transporter lain serta bukan merupakan bagian dari protein transporter ABC (ATP-binding cassette). Sekitar 71% asam amino penyusun YigM diprediksi membentuk 10 heliks transmembran dengan ujung N dan ujung C diprediksi berada di bagian sitoplasma. Dalam penelitian ini, kami mengkonstruksi yigM dari E. coli BL21(DE3) dengan tambahan urutan DNA yang mengkode His8×Tag dan sisi pemotongan HRV 3C protease pada ujung N- atau ujung C- protein. Kemampuan transpor biotin secara in vivo ditentukan melalui uji pertumbuhan dalam E. coli ?bioH ?yigM ?sbmA, strain E. coli dengan delesi gen yang mengkode protein yant terlibat dalam sintesis dan transpor biotin. Fraksi membran terinduksi disolubilisasi menggunakan molekul deterjen lauril maltosa neopentil glikol (LMNG) untuk selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi afinitas dan kromatografi gel filtrasi. Uji pertumbuhan dalam E. coli ?bioH ?yigM ?sbmA menunjukkan bahwa YigM rekombinan dengan maupun tanpa tambahan asam amino dapat mentransport biotin. YigM diekspresikan pada E. coli BL21(DE3) dengan kondisi optimum ekspresi menggunakan 0.4 mM IPTG pada suhu 25 °C selama 3 jam (dalam medium LB) dan 4 jam (dalam medium minimal M9). YigM yang dilarutkan dalam detergen berpotensi membentuk dimer ditunjukkan denga nadanya pita protein ~70 kDa dari hasil SDS-PAGE dan western blot setelah pemurnian akibat dari interaksi yang tidak spesifik. Karakterisasi dengan isothermal titration calorimetry (ITC) dan titrasi fluoresens menunjukkan bahwa apo-YigM dalam LMNG tidak dapat mengikat biotin. Hal ini ii dapat terjadi karena YigM yang diekspresikan di E. coli BL21 (DE3) telah jenuh akan biotin karena strain tersebut memiliki kemampuan untuk mensintesis biotin. Oleh karenanya, YigM berpotensi menjadi protein transporter biotin dengan afinitas tinggi. Faktor lain yang menyebabkan tidak adanya pengikatan biotin oleh YigM adalah adanya perubahan struktur apo-YigM jika dilarutkan dalam deterjen atau YigM membutuhkan protein lain untuk dapat mengikat dan mentranspor biotin.