Perpustakaan Digital ITB

Tuberkulosis (TB) merupakan satu dari sepuluh penyakit penyebab kematian terbesar di dunia yang diakibatkan oleh Mycobacterium tuberculosis (MTB). Bakteri ini dikenal memiliki faktor virulensi yang mampu meregulasi makrofag untuk mencegah apoptosis, membentuk struktur granuloma untuk bertahan hidup, dan beralih ke fase dorman yang membuat eliminasinya semakin sulit. Adanya kemampuan ini membuat pentingnya regulasi sitokin atau senyawa endogen lain yang bertanggung jawab pada proses tersebut untuk membantu eliminasi MTB. Oleh sebab itu, pencarian senyawa baru yang tidak hanya mampu membunuh MTB (selective bacteria) tetapi juga mampu meregulasi makrofag menjadi penting diteliti dalam upaya optimalisasi eliminasi MTB. Asam ursolat (UA) adalah salah satu senyawa golongan pentasiklik triterpenoid yang diketahui memiliki banyak aktivitas farmakologi salah satunya sebagai antituberkulosis. UA yang diisolasi dari beberapa tumbuhan diketahui memiliki aktivitas antituberkulosis pada beberapa galur MTB. Selain itu, UA menyebabkan penurunan konsentrasi asam mikolat yang diekstraksi dari MTB galur non virulen H37Ra. UA juga dilaporkan mampu meregulasi jalur persinyalan Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) pada sel leukemia yang berperan dalam produksi berbagai sitokin. Berdasarkan hal tersebut, UA dipilih untuk diteliti lebih lanjut sebagai antituberkulosis dan regulasinya pada makrofag selama infeksi. Tujuan penelitian ini adalah mengkaji mekanisme kerja UA sebagai antituberkulosis dan regulasinya pada makrofag selama infeksi oleh MTB. Penelitian diawali dengan uji aktivitas antituberkulosis UA secara in vitro pada MTB galur H37Rv, isolat klinis MTB resisten isoniazid-etambutol (HE), isolat klinis MTB resisten rifampisin streptomisin (RS), dan Mycobacterium avium galur 724. Penentuan antituberkulosis dilakukan dengan perhitungan nilai Colony Forming Unit (CFU). Penelitian dilanjutkan dengan uji kombinasi UA dan Obat Antituberkulosis (OAT) standar (isoniazid, etambutol, rifampisin, dan streptomisin) secara in vitro untuk melihat efek UA pada aktivitas OAT dalam membunuh MTB. Pengaruh UA terhadap morfologi dinding sel MTB diamati menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM). Gambaran awal mengenai dugaan mekanisme kerja UA spesifik sebagai inhibitor enzim pada MTB dianalisis menggunakan metode docking molekuler. Regulasi UA pada jalur persinyalan MAPK makrofag selama infeksi dilakukan dengan menganalisis kemampuan UA dalam memfosforilasi tiga jalur persinyalan MAPK antara lain Extracellular signal Regulated Kinase (ERK)1/2, Stress Activated Protein Kinase (SAPK)/ c-Jun NH2-terminal Kinase (JNK), dan p38. Mycobacterium avium digunakan sebagai agen infeksi dalam pengujian ini karena karakteristik paralel aktivitas intraselulernya dan kesamaan modulasi makrofag yang disebabkan oleh MTB. Kemampuan UA dan MTB dalam mengaktivasi jalur MAPK pada makrofag yang diinfeksi Mycobacterium avium juga ditentukan dengan menganalisis konsentrasi Tumor Necrosis Factor ?(TNF-?), Interleukin 1?(IL-1?), Interleukin 6 (IL-6), dan nitrit. Uji toksisitas akut UA pada model ikan zebra (Danio rerio) juga dilakukan sebagai analisis tambahan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa UA membunuh semua galur MTB uji yang digunakan pada konsentrasi 50 ?g/ml. Isoniazid, rifampisin, etambutol, dan streptomisin yang digunakan sebagai OAT pembanding terlihat hanya membunuh MTB galur H37Rv dengan konsentrasi masing-masing 0,2; 40; 2; dan 4 ?g/ml. UA juga memiliki efek sinergis ketika dikombinasi dengan isoniazid, etambutol, rifampisin, dan streptomisin dalam membunuh MTB galur H37Rv secara in vitro dengan rentang nilai Fraksi Kombinasi Inhibisi (FKI) 0,25-0,5. UA juga memperlihatkan efek sinergis ketika dikombinasi dengan rifampisin dalam membunuh isolat klinis MTB resisten RS secara in vitro dengan nilai FKI 0,5. Senyawa ini mampu merusak dinding sel dan membentuk lubang pada sel MTB galur H37Rv yang diamati dengan SEM. Isoniazid sebagai OAT pembanding juga memperlihatkan penurunan integritas dan kekakuan sel serta keluarnya cairan sitoplasma. Aktivitas UA pada dinding sel tersebut diperkuat dengan hasil docking molekuler yang memperlihatkan afinitas yang baik pada enzim InhA (berperan pada biosintesis asam mikolat dinding sel MTB di jalur Fatty Acid Synthase (FAS) II) dengan prediksi energi ikatan -9,30 kcal/mol. Enzim ini juga dimiliki oleh Mycobacterium avium dengan persentase kesamaan urutan asam amino sebanyak 85,50% dengan MTB serta ditemukannya asam amino tempat interaksi kompleks InhA MTB/UA hasil docking molekuler pada protein InhA Mycobacterium avium. Inkubasi makrofag dan Mycobacterium avium dapat meningkatkan konsentrasi TNF-? (9x lipat), IL-6 (195x lipat), IL-1?(4x lipat), dan nitrit (1x lipat) dibanding kontrol, sedangkan inkubasi bersama antara UA dan Mycobacterium avium pada makrofag mampu menghambat produksi keempat parameter uji tersebut secara signifikan. Analisis nilai CFU juga memperlihatkan tidak ditemukan koloni Mycobacterium avium baik pada lisat sel makrofag maupun supernatan pada kelompok konsentrasi terendah UA 50 ?g/ml. UA menyebabkan peningkatan konsentrasi IL-1?(2,5x lipat) dan nitrit (1,7x lipat) dibandingkan kontrol pada makrofag yang di pre inkubasi terlebih dahulu dengan Mycobacterium avium, tetapi konsentrasi TNF-?dan IL-6 tetap mengalami penurunan masing-masing sebesar 6,6x dan 4x lipat dibanding kontrol. Persentase penghambatan tertinggi pada pertumbuhan Mycobacterium avium dalam sel makrofag terjadi pada kelompok uji dengan konsentrasi UA 50 ?g/ml yaitu sebesar 44,75%. UA juga terlihat mampu menghambat fosforilasi jalur ERK1/2 (sebanding dengan kontrol) dan jalur MEK hingga 3x lipat dibandingkan kontrol menit ke-30, tetapi meningkatkan fosforilasi SAPK/JNK hingga 8x lipat dibanding kontrol menit ke-30 pada makrofag yang diinfeksi Mycobacterium avium. Uji toksisitas akut UA pada model ikan zebra (Danio rerio) menghasilkan nilai Lethal Concentration (LC) 50 152,5±3,5 mg/l dan termasuk ke dalam kategori tidak toksik. Informasi yang dapat diberikan dari hasil penelitian ini adalah UA memiliki efek bakterisidal pada MTB dengan cara merusak dinding sel MTB yang didukung dengan hasil docking molekuler yang memperlihatkan afinitas pada enzim InhA. UA juga mampu meregulasi jalur persinyalan MAPK, produksi sitokin, dan nitrit sehingga kombinasi dengan OAT standar diharapkan dapat meningkatkan kemampuan OAT tersebut dalam mengeliminasi MTB terutama MTB intraseluler.