Perpustakaan Digital ITB

Kolagenase yang berasal dari Bacillus licheniformis F-11.4 telah berhasil digunakan untuk menghidrolisis kolagen ikan gabus menjadi peptida bioaktif. Berdasarkan hasil LC-MS/MS, diprediksi bahwa enzim berukuran 26 kDa tersebut adalah metal-dependent hydrolase (EC 3.4.24). Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh enzim metal-dependent hydrolase rekombinan dari B. licheniformis F-11.4 melalui pendekatan konstruksi gen sintetik dan mengkarakterisasi aktivitasnya. Data mengenai metal-dependent hydrolase B. licheniformis F-11.4 masih sangat terbatas pada NCBI, sehingga penentuan urutan DNA-nya dilakukan dengan perancangan primer universal yang dilanjutkan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dan sekuensing DNA. Optimasi kodon gen sintetik dilakukan dengan menggunakan preferensi kodon Escherichia coli sebagai inang ekspresi. Gen sintetik diproduksi pada vektor ekspresi pJ414 yang memiliki jumlah salinan tinggi. Plasmid rekombinan yang mengandung gen sintetik selanjutnya ditransformasi pada E. coli BL21(DE3) dengan metode panas kejut. Overproduksi metal-dependent hydrolase rekombinan dilakukan pertama kali pada skala kecil dengan optimasi induksi IPTG (0,1; 0,5; dan 1 mM). Overproduksi skala besar dilakukan dengan induksi IPTG 1 mM pada 37 °C selama 3 jam. Protein dimurnikan dengan metode kromatografi afinitas pada kolom resin Ni-NTA. Metal-dependent hydrolase rekombinan dikarakterisasi bobot molekulnya dengan metode Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Uji aktivitas dilakukan dengan metode zimografi pada 4 subtrat berbeda yaitu kolagen ikan gabus, kolagen sapi, gelatin, dan kasein. Hasil penelitian menunjukkan bahwa urutan DNA pengkode metal-dependent hydrolase B. licheniformis F-11.4 berhasil ditentukan yaitu memiliki ukuran sebesar 690 pasang basa. Gen sintetik pengkode metal-dependent hydrolase rekombinan berhasil dikonstruksi dengan nilai Codon Adaptation Index (CAI) dan persentase GC berturut-turut sebesar 0,838 dan 51,3%. Enzim rekombinan berhasil diperoleh dan memiliki bobot molekul 26 kDa berdasarkan hasil analisis SDS-PAGE. Namun, enzim rekombinan tidak memiliki aktivitas kolagenolitik, gelatinolitik, ataupun kaseinolitik.