Perpustakaan Digital ITB

Epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) merupakan suatu EGFR mutan yang hanya terekspresi pada beberapa jenis sel kanker. Sifat ini menjadikannya ideal sebagai target molekuler pada terapi kanker terarah berbasis imunologi. Salah satu sistem penghantar potensial yang menjadikan EGFRvIII sebagai target molekuler adalah single-chain variable fragment (scFv) antibody. Fragmen antibodi scFv rekombinan dalam bentuk natif dapat diproduksi di periplasma sel Escherichia coli. Pada penelitian sebelumnya telah berhasil dikonstruksi kerangka baca terbuka dari DNA pengkode scFv1 (VH-linker-VL) dan scFv2 (VL-linker-VH) anti-EGFRvIII untuk diekspresikan di Pichia pastoris. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan subkloning DNA pengkode scFv1 dan scFv2 ke vektor ekspresi pJ414 dan menganalisis produk ekspresinya di periplasma E. coli BL21(DE3). DNA pengkode scFv1 dan scFv2 diamplifikasi dari plasmid pJ201:57086-AFseq_optPp dan pTz_scFv2 dengan metode PCR menggunakan primer spesifik. Masing-masing produk PCR diklon ke vektor ekspresi pJ414 dan dilanjutkan dengan transformasi plasmid rekombinan (pJ414_scFv1 dan pJ414_scFv2) ke sel E. coli TOP10. Plasmid rekombinan dikarakterisasi menggunakan analisis migrasi, pemotongan dengan enzim restriksi, PCR dan penentuan urutan nukleotida. Protein scFv1 dan scFv2 diproduksi pada E. coli BL21(DE3) rekombinan dengan induksi IPTG menggunakan konsentrasi akhir masing-masing 0,1 dan 1 mM. Overproduksi dilakukan pada 20-23 °C selama 20 jam. Protein total didapatkan dengan melisis pelet sel menggunakan dapar lisis dan pemanasan. Protein periplasma diisolasi dari pelet sel menggunakan larutan hipertonik dan sisa sferoplas dilisis menggunakan metode beku cair untuk mendapatkan protein sitoplasma. Protein total, protein periplasma dan protein sitoplasma dianalisis dengan SDS-PAGE serta Western Blot menggunakan antibodi primer anti-His. Hasil analisis protein scFv1 dan scFv2 dengan kedua metode tersebut menunjukkan adanya pita protein di fraksi periplasma berukuran 28,76 dan 29,81 kDa.