Article Details

PENGEMBANGAN INTERFERON ALFA 2B MANUSIA REKOMBINAN BIOSIMILAR MELALUI EKSPRESI DI PERIPLASMA ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)

Oleh   Adhitya Jessica [20712046]
Kontributor / Dosen Pembimbing : Prof. Dr. Heni Rachmawati, Apt., M.Si.;Prof. Dr. Debbie Soefie Retnoningrum;
Jenis Koleksi : S2 - Tesis
Penerbit : SF - Farmasi
Fakultas : Sekolah Farmasi (SF)
Subjek :
Kata Kunci : Interferon alpha2b, biosimilar, Enterotoksin II, osmotic shock, Escherichia coli BL21 (DE3).
Sumber :
Staf Input/Edit : yana mulyana  
File : 1 file
Tanggal Input : 2019-12-02 14:41:25

Interferon-?2b manusia rekombinan (rhIFN?2b) sebagai produk biosimilar harus memiliki urutan asam amino yang identik dengan bentuk natifnya di dalam tubuh manusia. Ketidakidentikan residu asam amino ujung-N rhIFN?2b yang diproduksi menggunakan sel inang Escherichia coli BL21(DE3) (E. coli BL21(DE3)) salah satunya dapat ditanggulangi dengan mengekspresikan protein tersebut ke kompartemen periplasma. Konstruksi gen pengkode rhIFN?2b hingga transformasi plasmid rekombinan pET16b-rhIFN?2b ke dalam E. coli TOP10 telah dilakukan pada penelitian sebelumnya. Penelitian ini difokuskan pada optimasi kondisi overproduksi, isolasi protein periplasma, dan proses pemurnian rhIFN?2b. E. coli BL21(DE3) yang membawa pET16b-rhIFN?2b difermentasi pada beberapa variasi konsentrasi induser, waktu dan suhu induksi. Isolasi protein periplasma menggunakan metode osmotic shock. Penambahan kation divalen adalah parameter yang dioptimasi. Pemurnian dilakukan dengan kromatografi filtrasi gel dan kromatografi penukar ion. Kromatografi penukar ion menggunakan sistem gradien konsentrasi NaCl dan pH. rhIFN?2b dikarakterisasi dengan analisis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Elektroforesis (SDS PAGE) dan diidentifikasi dengan analisis Western blot. Kondisi overproduksi yang optimal adalah pada penambahan 0,1 mM IPTG, dengan suhu induksi 25 o C, selama 18 jam. Isolasi protein periplasma menggunakan metode osmotic shock dimodifikasi dengan penambahan MgCl2. Analisis protein total dengan SDS PAGE menunjukkan pita tebal di antara marka berukuran 18,4 dan 25 kDa. Pita tersebut sejajar dengan pita tipis protein pada fraksi periplasma yang dianilisis dengan metode yang sama. Pita protein tersebut diduga merupakan pita protein rhIFN?2b. Analisis fraksi sitoplasma dan periplasma E. coli BL21(DE3) dengan Western blot menunjukkan pita pada membran nitroselulosa di antara marka protein berukuran 18,4 dan 25 kDa. Kondisi overproduksi dan metode osmotic shock hasil optimasi dapat digunakan untuk memperoleh fraksi periplasma. rhIFN?2b terdapat dalam fraksi periplasma dengan kondisi overproduksi dan isolasi yang dilakukan. Analisis dengan metode LC MS/MS perlu dilakukan untuk menentukan apakah rhIFN?2b yang terdapat pada fraksi periplasma masih dalam keadaan fusi dengan leader sequence enterotoksin II. Optimasi purifikasi lebih lanjut perlu dilakukan agar dihasilkan protein periplasma dalam jumlah yang tinggi.