Di Indonesia penggunaan tembakau (Nicotianan tabacum L.) dikenal sebagai bahan utama rokok. Pada
beberapa penelitian, ekstrak tembakau telah teruji memiliki manfaat sebagai insektisida alami. Selain
itu pada beberapa penelitian aktivitas antibakteri pada daun tembakau telah teruji pada beberapa
ekstrak daun tembakau dengan pelarut yang berbeda-beda. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi
dan menentukan golongan senyawa berkhasiat dari daun tembakau terhadap bakteri uji yaitu
Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Serbuk simplisia daun
tembakau diekstraksi dengan metode refluks menggunakan pelarut dari kepolaran bertingkat yaitu nheksana, etil asetat, dan etanol, kemudian dilakukan pemantauan terhadap ketiga ekstrak dengan
metode kromatografi lapis tipis. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar,
penentuan nilai konsentrasi hambat minimum dengan mikrodilusi, dan dilakukan biootografi untuk
menentukan senyawa target berdasarkan Rf yang memiliki aktivitas hambat. Berdasarkan hasil uji
pendahuluan dengan difusi agar, ekstrak yang memiliki diameter hambat paling besar yaitu ekstrak etil
asetat. Uji mikrodilusi meununjukan nilai konsentasi hambat minimum terendah adalah ekstrak etil
asetat yaitu 4096 µg/mL pada bakteri Staphylococcus aureus dan 8192 µg/mL pada bakteri
Pseudomonas aeruginosa. Sehingga berdasarkan hasil tersebut, ekstrak etil asetat dilanjutkan ke tahap
berikutnya. Hasil dari biootografi menunjukan komponen ekstrak etil asetat pada Rf 0,66 dalam
pengembang kloroform-etil asetat (1:1) memberikan aktivitas antibakteri terhadap kedua bakteri uji.
Fraksinasi dilakukan dengan metode kromatografi cair vakum. Hasil fraksinasi dipantau menggunakan
metode kromatografi lapis tipis dan pemurnian dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif.
Diperoleh isolat dengan aktivitas antibakteri yang berdasarkan hasil karakterisasi menggunakan
penampak bercak spesifik, isolat merupakan senyawa kumarin.