Perpustakaan Digital ITB

Protein A TP-hinding cassette (ABC) mer upakan protein membran yang membutuhkan adcnosin trifosfat (ATP) sebagai sumber encrgi dalam mcnjalankan fungsinya. Protein ABC mcmiliki banyak fungsi penting di dalam sc i, seperti mentran por nutrisi kc dalam sel. mcntranspor senyawa -senyawa kimia antar mcmbran organcl, membantu sekrcsi protein, memprcsentasikan antigen (peptida), mercgulasi sel dan sin tcsis protein, dan membantu proses detoksifikasi. Sa lah satu jenis dari protein ABC adala h energy-coupling factor (ECF) transporter yang berfungsi untuk membawa mikronutlien dari luar sel ke dalam scl. ECF transporter merupakan protein kompleks asimctris yang tcrdiri dari cmpat protein berbeda, yaitu dua protein berada pada sitoplasma dan dua protein berada pada membran lipid bilayer. Hipote i s dari mekanisme transport ECF transporter sudah ditentukan. Akan tctapi, struktur ECF transporter yang sudah berhasil diselcsaikan masi h mcmiliki orientasi yang sama, schingga masih belum cukup untuk menentukan secara pasti mekanisme transpor dari ECF transporter. Dalam pcnelitian ini digunakan pendekatan kristalografi untuk menentukan mckanisme ECF transporter. Tanta ngan utama dalam kristalisasi protein membran ada lah mcndapatkan krista l pada resolusi tinggi (-3 A). Kristalisasi chaperone mcrupakan mctode yang mcnjanjikan untuk meningkatkan kestabilan protein. Kristalisasi chaperone adala h sebuah protein yang dapat membantu kristalisasi protein lain, sala h satu contohnya ada lah ant ibod i monoklonal. Pada pcnelitian ini digunakan nanobod i sebagai chaperone untu k kristalisasi. Nanobod i dihasilkan dari imunisasi llama dan pustaka genomnya dibuat pada phage display. Dari hasi l seleksi, dihasilkan 42 nanobodi dengan urutan gen berbeda da n 2 1 famili yang bcrbeda berdasarkan kesamaan dari urutan CDR3. Pada penelitian ini, 7 nanobodi yang dikarakterisasi lebih lanjut berasal dari famili yang berbcda. Nanobodi diproduksi pada E. coli WK6 dan diinduksi menggunakan Isopropyl P­ D-1-thiogalactopyranoside ( lPTG). Protein dimumikan menggunakan Nikel kromatografi afinitas. Kemudian, bufer elusi pada nanobod i diubah mcla l ui kolom desalting. Konsentrasi nanobod i mumi yang didapatkan pada I L kulture adalah -1-2 mg. ECF transporter diproduksi pada E. coli MC1061 dan diinduksi menggunakan L­ (+)-Arabinosa. Selubung membran yang mengandung ECF transporter diektrak melalui penghancuran sel menggunakan cell disrupter dan ultrasentrifugasi. Solubilisasi pada protein ini dilakukan dengan n-dodesil- -0-maltosida (DDM). Kemudian protein dimumikan mcnggunakan Nikel kromatografi afinitas dan gel filtrasi analitis (AGF). lnteraksi antara nanobodi pada 7 famili yang berbeda dengan ECF transporter diana!isis lebih Ianjut melalui ko-elusi. Karakterisasi ikatan dilakukan melalui AGF, analisis SDS-PAGE, kalorimctri titrasi isotcm1al, dan aktivitas transpor secara in vitro. Bcrdasarkan AGF, scbanyak 6 nanobodi (Nb) terikat pada ECF transporter dan sccara spcsifik terikat pada domain ECF modul. Namun, I nanobodi. Nb 62, tidak dapat berikatan dengan baik pada ECF transporter ECF PanT pada keadaan APO protein. Nb 86 memiliki afinitas pada rentang nanomolar dan dapat menghambat 95% aktivitas transpor. Nb memberikan efek yang menjajikan pada kristalisasi ECF transporter. Berdasarkan inhibisi terbaik pada aktivitas transport, Nb 86 dipilih untuk memediasi pembentukan kristal ECF FolT2. Krista! EcfFoiT2-Nb86 berhasilkan terbcntuk pada kondisi 0,05 M Mg(CH3C00h4H::O, 0,1 M MES pH 6,5 and 26% (v/v) PEG 400 dengan inkubasi selama 5 hari pada suhu 8 °C. Sclain itu, ko­ kristalisasi ECF Pdx dicoba menggunakan tiga jenis nanobodi yang berbeda. yaitu Nb 81, Nb 89, dan Nb 91. ECF Pdx dengan Nb 91 mcnghasi l kan kristal yang mcnjanjikan pada kondisi 0,08 M Mg(CH3COOh 4H:!O, 0, I M Na-citrate pH 6 and 14% (v/v) PEG 5000 MME dengan inkubasi selama 35 hari pada suhu 8 °C.