digilib@itb.ac.id +62 812 2508 8800

ABSTRAK Laelia Munawaroh
PUBLIC Latifa Noor

COVER Laelia Munawaroh
PUBLIC Latifa Noor

BAB1 Laelia Munawaroh
PUBLIC Latifa Noor

BAB2 Laelia Munawaroh
PUBLIC Latifa Noor

BAB3 Laelia Munawaroh
PUBLIC Latifa Noor

BAB4 Laelia Munawaroh
PUBLIC Latifa Noor

BAB5 Laelia Munawaroh
PUBLIC Latifa Noor

PUSTAKA Laelia Munawaroh
PUBLIC Latifa Noor

Beberapa mikroorgani sme yang dii solasi dari kompos diketahui memiliki aktivitas lipase yang baik. Lipase merupakan enzim yang memiliki aplikasi yang luas dalam berbagai proses bioteknologi industri misalnya dalam industri makanan yaitu dalam proses pembuatan keju atau coklat; pada industri farrnasi sebagai pengarah enantioselektif pada pembuatan o bat dari suat u rasemat; dan pada industri biod iesel sebagai katali s reaksi transesterifik asi. Tingginya potensi lipase sebagai biokatalis dalam berbagai proses industri mendorong dikembangkannya berbagai penelitian baru untuk meningkatkan produksi lipase. Salah satu upaya yang dapat dilakukan ialah melalui teknologi DNA rekombinan. Teknologi DNA rekombinan merupakan suat u serangkaian proses bi oteknologi yang memungkinkan dilak ukannya modifikasi gen, mengisolasi gen. d an mengekspresikan gen dalam organi sme lain. Gen yang mengkode lipase d engan nama lk-1 yang berasal dari isolat kompos sampah organik sebelumnya telah berhasil diklon dan diekspresikan secara intraseluler ke dalam sel heterolog Escherichia coli BL21 (DE3) dengan menggunakan pET30(a) se bagai vektor ekspresi. Lipase rekombinan yang dihasilka n dari penelitian tersebut memiliki akti vitas yang rendah karena te1jadinya badan inklusi. U ntuk mengatasi masalah tersebut, pada penelitian ini dilakukan ekspresi gen pengkode lipase /k-1 menggunakan sel inang Pichia pastoris, dengan harapan dapat diperoleh lipase rekombinan yang aktif dan fungsional. Pichia pastoris merupakan suatu ragi metilotropik yang memanfaatkan metanol sebaga i sumber karbonnya. Ekspresi pada Pichia pas /oris memiliki keuntw1gan d iantaranya dapat melakukan mod ifikasi pasca translasi , dapat tumbuh hingga mencapai d ensitas se l tinggi tanpa terjadi nya akumulasi etanol , teknik yang digunakan rel atif mudah. dan mud a hnya proses scalling-up dengan menggunakan fermentor. Strategi yang dilakukan di awa l penelitian adalah proses subkloning gen yang bertujuan untuk memperol eh plasmid rekombinan yang membawa gen si sipan /k-1. Proses konstruksi pl asmid rekombinan melalui serangkaian tahapan isolasi gen lk-1 yang sebel umnya terd apat da lam vektor pET30(a), lalu mengamplifik asi gen tersebut menggunakan d u a pasang primer. Dari hasil tersebut diperoleh gen fk-1 yang memiliki ukuran 936 pb. Gen lk-1 yang diperoleh selanjutnya diligasikan ke d alam vektor pGEM-T easy dan digunakan untuk mentransfonnasi Escherichia coli TOPJ OF'. Dari hasi l tersebut. dilakukan kembali isolasi dan amplifikasi gen lk-1 untuk selanjutnya diligasikan ke dalam pPICZaA. Plasmid pPICZaA-/k-1 terse but digunakan untuk mentransformasi Escherichia coli TOP!OF'. Plasmid rekombinan pPICZaA-lk-1 terfusi dengan sinyal sek resi a-mating factor dan dibawah regulasi promotor inducible AOX 1. Plasmid rekombinan pPICZaA-/k-1 telah berhasil dikonstruksi dan terkonfirmasi bahwa plasmid rekombinan tersebut mengandung gen si sipan lk-1. Hal ini dibuktikan d engan munculnya satu pita berukuran 1 500 pasang basa pada elektroforegram hasil PCR plasmid rekombinan dengan menggunakan sepasang primer AOX. Selanjutnya, plasmid rekombinan pPICZaA-LK-1 yang telah dikonstruksi digunakan untuk mentransformasi Pichia pastoris. Beberapa transforman yang diperoleh di seleksi pada media YPD mengandung zeocin dengan variasi konsentrasi 1 000 1-1g/ml dan 2000t g/ml. Tran sforman yang tumbuh dengan baik pada media dengan konsentrasi zeocin 2000 IJg/ml diduga membawa kaset ekspresi yang multikopi. Transforman tersebut dipilih dan diekspresikan untuk memperoleh lipase rekombinan. Ekspresi gen pengkode lipase terjadi ketika dilakukan induksi dengan metano l setiap 24 jam dengan memanfaatkan penggunaan promotor AOX. Analisis terhad ap hasil ekspresi protein rekombinan dilakukan melalui analisis aktivitas protein rekombinan dengan mengukur kemam puan hidrolisis lipase terhadap substrat PNP-Laurat. Pada tahap ekspresi ini dilakukan optimasi pemilihan koloni, optimasi waktu ekspresi optimum, dan optimasi konsentrasi metanol. Tujuan dilakukannya optimasi tersebut untuk memperoleh lipase rekom binan dengan akti vitas tert inggi. Dari hasil optimasi tersebut, koloni nomor 12 merupakan koloni yang mengekspresikan lipase rekombinan paling optimum, dengan wakt u ekspresi terba ik pada hari ke lima menggunakan methanol 0,5%. Profil dari protein rekombinan dianalisis mel alui elektroforesis SDS PAGE. Melalui elektroforegram hasil SDS PAGE teramati munculnya pita berukuran 36.53 kDa yang didu ga merupakan pita protein lipase rekom binan. Lipase rekombinan yang diperoleh dimurnikan dengan menggunakan kromatografi NiĀ­ NTA, dan dihasi lkan aktifitas lipase sebesar 0,9313 U/mg meningkat cuk up signifikan dibandingkan ekstrak kasar lipase dengan aktifitas sebesar 0,0699 U/mg.