Article Details

KLONING, KARAKTERISASI DAN EKSPRESI GEN PENGKODE LIPASE TERMOSTABIL DARI KOMPOS MELALUI PENDEKATAN METAGENOM

Oleh   Nurhasanah [30510010]
Kontributor / Dosen Pembimbing : Prof. Akhmaloka, Ph.D.;Prof. Dra. Fida Madayanti Warganegara, MS, Ph.D.;Dr. Santi Nurbaiti;
Jenis Koleksi : S3-Disertasi
Penerbit : FMIPA - Kimia
Fakultas : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA)
Subjek : Chemistry
Kata Kunci : lipase termostabil, kompos, metagenom, Pseudomonas stutzeri, kloning, ekspresi.
Sumber :
Staf Input/Edit : Alice Diniarti   Ena Sukmana
File : 7 file
Tanggal Input : 2019-01-04 08:58:28

Lipase merupakan salah satu enzim hidrolase yang memiliki banyak peran didalam dunia industri. Hal ini disebabkan lipase memiliki kemampuan untuk mengkatalisis reaksi dalam fasa antarmuka dan antara pelarut. Enzim ini mempunyai sifat yang khas sehingga banyak digunakan dalam berbagai lapangan industri seperti industri makanan, farmasi, detergen, kertas, kulit, biodisel, pengolahan limbah, tekstil, medik dan sintesis senyawa organik. Pemanfaatan lipase yang cukup luas di berbagai bidang dan meningkatnya kebutuhan dunia pada enzim ini, mendorong untuk dilakukannya usaha pencarian jenis-jenis lipase baru dari berbagai sumber alam. Salah satu pendekatan yang saat ini banyak dilakukan untuk mengeksplorasi lipase adalah melalui pendekatan culture independent atau disebut juga pendekatan metagenom. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan keragaman gen pengkode lipase termostabil dari kompos dan mengetahui sifat lipase yang dihasilkan. Penelitian ini menggunakan sampel kompos yang diambil pada fase termofilik (45 °C – 68 °C). DNA total dari komunitas kompos diisolasi secara langsung tanpa melalui kultivasi. Gen pengkode lipase diisolasi melalui teknik PCR menggunakan beberapa pasang primer yang telah dirancang oleh beberapa peneliti sebelumnya di laboratorium Biokimia ITB. Produk PCR yang terbentuk dari masing-masing primer telah diklon ke dalam vektor kloning pJet1.2/blunt dan ditentukan urutan nukleotidanya. Penjajaran hasil urutan nukleotida dari beberapa klon yang diperoleh, memperlihatkan adanya lima gen pengkode lipase yang berbeda. Hasil translasi in silico urutan nukleotida kelima sampel menunjukkan keidentikan yang tinggi dengan genus Pseudomonas dan keidentikan terdekat dengan klon lipase Pseudomonas stutzeri (AID66451.1) dengan tingkat keidentikan antara 96-100%. Sedangkan penjajaran di antara sampel menghasilkan keidentikan tertinggi sekitar 99,6 % dan terendah sekitar 85,2 %. Hasil analisis filogenetik juga memperlihatkan bahwa kelima sampel membentuk cabang yang berbeda walaupun masih memiliki kedekatan dengan lipase P. stutzeri (AID66451.1). Hal ini menyarankan bahwa kelima sampel yang diperoleh dari kompos fase termofilik merupakan sampel yang berbeda. Perbedaan beberapa residu asam amino dan posisinya terjadi baik antara sampel maupun dengan lipase P. stutzeri (AID66451.1). Perbedaan terbesar ditemukan pada 2 sampel yaitu LK3 dan LK5. Sampel LK3 memiliki ukuran yang lebih pendek yaitu 280 asam amino dan merupakan sampel yang mengalami delesi pada 31 residu asam amino didaerah N terminal sehingga menyebabkan sampel LK3 tidak memiliki sinyal peptida. Sedangkan sampel LK5 memiliki ukuran yang sama dengan ketiga sampel lainnya yaitu 311 asam amino namun terdapat perbedaan pada beberapa residu asam amino, perbedaan terbesar ditemukan pada daerah lestari disekitar residu katalitik aspartat. Adanya perbedaan pada beberapa residu asam amino yang ditemukan diantara sampel diduga akan menghasilkan sifat dan karakter lipase yang berbeda baik antara lipase sampel maupun dengan lipase P. stutzeri (AID66451.1) yang berasal dari lingkungan halofilik. Hasil analisis keidentikan urutan asam amino kelima sampel dengan beberapa lipase famili I.1 memperlihatkan adanya daerah lestari yang sama dimiliki oleh kelima sampel. Beberapa daerah lestari tersebut di antaranya adalah daerah tetrapeptida, pentapeptida, catalytic triad dan juga beberapa residu penting yang berperan dalam pembentukan folding protein. Berdasarkan hasil analisa ini dapat disimpulkan bahwa lipase kelima sampel yang diperoleh dari kompos termogenik termasuk dalam kelompok lipase famili I.1. Prediksi stuktur 3D terhadap kelima sampel, secara umum tidak banyak perbedaan. Perbedaan terbesar terlihat pada sampel LK5 yang berbeda pada beberapa residu asam amino disekitar pusat katalitik aspartat. Hasil superimposed yang dilakukan terhadap model struktur lipase Pseudomonas aeruginosa (PDB ID 1EX9) sebagai pembanding menunjukkan adanya perbedaan konformasi yang terjadi pada pusat aktif enzim yang diduga akan memberikan pengaruh terhadap aktivitas enzim yang dihasilkan.. Tiga sampel dipilih untuk dipindahkan ke vektor ekspresi pET30a. Hasil ekspresi ketiga sampel pada kondisi penambahan IPTG 1 mM sebagai induser, selama 4 jam pada suhu 37 °C, 150 rpm memperlihatkan adanya protein fusi yang berukuran sekitar 34 kDa untuk LK2, 31 kDa untuk LK3 dan 28 kDa untuk LK5. Kuantisasi terhadap protein hasil ekspresi menunjukkan bahwa ketiga protein sampel terekspresi sekitar 30,89 % untuk LK2, 44,38 % untuk LK3 dan 21,67 % untuk LK5. Hasil uji terhadap aktivitas lipase menggunakan substrat p-nitrofenil laurat (C12) pada kondisi reaksi suhu 50 °C, dan bufer pospat pH 8, memberikan aktivitas spesifik untuk LK2 = 1,493 U/mg; LK3 = 0,938 U/mg dan LK5 = 1,101 U/mg. Hasil ini menunjukkan bahwa protein terlarut yang diperoleh merupakan protein aktif dengan aktivitas yang cukup baik. Pada penelitian ini, pendekatan metagenom dari kompos fase termogenik terbukti berhasil mendapatkan gen lipase dengan keragaman yang cukup tinggi. Kelima sampel yang diperoleh merupakan gen lipase termostabil dari kelompok Pseudomonas yang ditemukan di kompos rumah tangga asal Indonesia. Lipase termostabil yang diperoleh diharapkan memiliki sifat dan karakter yang berbeda dari yang telah ada. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap protein yang dihasilkan guna mendapatkan informasi tentang sifat dan karakter lipase yang diperoleh dari lingkungan kompos ini.