Protein disulfida isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) yang dikode oleh gen
PDII ragi S. cerevisiae merupakan katalis dalam reaksi oksidasi gugus
thiol, reduksi dan isomerisasi ikatan disulfida pada molekul protein. PDI
tersusun atas dua subunit. Masing-masing subunit terdin dari domain a,
b, b', a' dan c. Penelitian ini bertujuan mengkontruksi dan
mengkarakterisasi mutan pdi yang tidak mengandung domain b' (pdi-
Ab'). Mutan pdi-Ab' dikonstruksi dengan cara mendelesi fragmen DNA
domain b' dari gen PDII ragi menggunakan metode PCR. Delesi
ragmen DNA domain b' telah dilakukan melalui tiga kali tahapan PCR.
PCR pertama digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA domain
a'-c (± 447 pb). Ujung 3' fragmen DNA hasil PCR pertama mempunyai
beberapa nukleotida yang dapat membentuk pasangan komplemen
dengan nukleotida ujung 5' dari domain b'. Fragmen DNA ± 447 pb
selanjutnya digunakan sebagai primer untuk menghasilkan fragmen
DNA ± 1190 pb bersama primer lain dalam PCR kedua. PCR ketiga
dilakukan untuk mengoptimurnkan fragmen DNA ± 1190 pb basil PCR
kedua. Fragmen DNA ± 1190 pb ini sesuai untuk fragmen DNA domain
a-b-a'-c. Fragmen DNA ± 1190 pb basil PCR disubkloning
menggunakan vektor pGemT. Rekombinan pGem T- pdil-Ab' kemudian
dipotong dengan enzim restriksi NdeI dan BamHI. Fragmen DNA ±
1190 pb basil pemotongan oleh enzim NdeI dan Banff disubkloning
vektor ekspresi E. coli, pT 7.7. Urutan nukleotida fragmen DNA ± 1 190
pb yang telah dianalisis dengan metode dideoksi menunjukkan tidak
adanya mutasi pada fragmen DNA ± 1190 pb. Ekspresi mutan pdil-Ab'
menghasilkan protein dengan berat molekul ± 45 kDa, sementara PDI
wild type mempunyai berat molekul ± 60 kDa. Mutan pdi-Ab'
mempunyai aktivitas mereduksi ikatan disulfida insulin sebesar 52
dari wild type-nya. Delesi domain b' menurunkan kooperatititas diantara
domain-domain lain PDI dalam mengikat substrat. Domain b' diduga
berperan penting untuk afinitas pengikatan substrat. Mutan pdi-Ab'
bersifat lebih sensitif terhadap protemase K. Gejala ini menunjukkan
bahwa mutan pdi-Ab' mungkin mempunyai stabilitas konfonnasi yang
berbeda dari PDI wild type.