digilib@itb.ac.id +62 812 2508 8800

PURKAN
PUBLIC Alice Diniarti

Protein disulfida isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) yang dikode oleh gen PDII ragi S. cerevisiae merupakan katalis dalam reaksi oksidasi gugus thiol, reduksi dan isomerisasi ikatan disulfida pada molekul protein. PDI tersusun atas dua subunit. Masing-masing subunit terdin dari domain a, b, b', a' dan c. Penelitian ini bertujuan mengkontruksi dan mengkarakterisasi mutan pdi yang tidak mengandung domain b' (pdi- Ab'). Mutan pdi-Ab' dikonstruksi dengan cara mendelesi fragmen DNA domain b' dari gen PDII ragi menggunakan metode PCR. Delesi ragmen DNA domain b' telah dilakukan melalui tiga kali tahapan PCR. PCR pertama digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA domain a'-c (± 447 pb). Ujung 3' fragmen DNA hasil PCR pertama mempunyai beberapa nukleotida yang dapat membentuk pasangan komplemen dengan nukleotida ujung 5' dari domain b'. Fragmen DNA ± 447 pb selanjutnya digunakan sebagai primer untuk menghasilkan fragmen DNA ± 1190 pb bersama primer lain dalam PCR kedua. PCR ketiga dilakukan untuk mengoptimurnkan fragmen DNA ± 1190 pb basil PCR kedua. Fragmen DNA ± 1190 pb ini sesuai untuk fragmen DNA domain a-b-a'-c. Fragmen DNA ± 1190 pb basil PCR disubkloning menggunakan vektor pGemT. Rekombinan pGem T- pdil-Ab' kemudian dipotong dengan enzim restriksi NdeI dan BamHI. Fragmen DNA ± 1190 pb basil pemotongan oleh enzim NdeI dan Banff disubkloning vektor ekspresi E. coli, pT 7.7. Urutan nukleotida fragmen DNA ± 1 190 pb yang telah dianalisis dengan metode dideoksi menunjukkan tidak adanya mutasi pada fragmen DNA ± 1190 pb. Ekspresi mutan pdil-Ab' menghasilkan protein dengan berat molekul ± 45 kDa, sementara PDI wild type mempunyai berat molekul ± 60 kDa. Mutan pdi-Ab' mempunyai aktivitas mereduksi ikatan disulfida insulin sebesar 52 dari wild type-nya. Delesi domain b' menurunkan kooperatititas diantara domain-domain lain PDI dalam mengikat substrat. Domain b' diduga berperan penting untuk afinitas pengikatan substrat. Mutan pdi-Ab' bersifat lebih sensitif terhadap protemase K. Gejala ini menunjukkan bahwa mutan pdi-Ab' mungkin mempunyai stabilitas konfonnasi yang berbeda dari PDI wild type.