Perpustakaan Digital ITB

Lipase (triasilgliserol hidrolase, EC 3.1.1.3) adalah enzim yang secara alami mengkatalisis hidrolisis trigliserida dengan rantai karbon panjang yang tidak larut dalam air. Dewasa ini lipase banyak dikembangkan untuk mengkatalisis reaksi sintesis senyawa organik. Untuk itu diperlukan lipase yang memiliki stabilitas terhadap pelarut organik. Lipase yang stabil dalam kondisi ekstrim seperti pelarut organik umumnya diperoleh dari mikroorganisme yang dapat hidup dalam lingkungan dengan kondisi ekstrim (extremophiles). Salah satunya adalah mikroorganisme halofilik yang dapat hidup dalam lingkungan dengan kadar garam tinggi (aktivitas air rendah) memiliki potensi menghasilkan lipase yang stabil dalam pelarut organik. Pada penelitian ini mikroorganisme halofilik diisolasi dari sumber air garam kawah lumpur “Bledug Kuwu” yang berlokasi di Desa Kuwu Kecamatan Kradenan, Purwodadi Jawa Tengah. Tujuan penelitian ini adalah untuk memperoleh lipase yang stabil terhadap pelarut organik dari mikroorganisme halofilik dari sumber air garam tersebut. Sampel air garam diambil dari tempat penampungan air yang keluar dari letupan kawah lumpur. Mikroorganisme dalam sampel air ditumbuhkan dalam media Luria Bertani (LB) cair dengan komposisi tripton 0,1%, ekstrak ragi 0,05%, NaCl 5%, dan air sampel, diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Sebanyak 20 koloni yang tumbuh dipilih secara acak dan diuji toleransinya terhadap kadar NaCl menggunakan media padat dengan komposisi tripton 0,1%, ekstrak ragi 0,05%, bacto agar 2%, dan NaCl (0-30%). Semua koloni kemudian diuji potensi lipolitiknya menggunakan media padat dengan komposisi pepton 0,5%, ekstrak ragi 0,5%, CaCl2 0,05%, NaCl 5%, bacto agar 2%, suspensi substrat (minyak olive 2,5%, tween 80 1,0%), dan indikator warna rhodamin B 2,0%. Koloni yang menunjukkan potensi lipolitik kemudian diisolasi dari campuran menggunakan teknik sebar dan gores empat kuadran. Isolat tunggal yang diperoleh diidentifikasi dengan uji pewarnaan Gram, analisis gen 16s rRNA dan konstruksi pohon filogenetik. Lipase diproduksi dari isolat tunggal menggunakan media cair dengan komposisi pepton 0,5%, ekstrak yeast 0,5%, CaCl2 0,05%, NaCl 0,1%. Ekstrak kasar lipase difraksinasi menggunakan aseton dan amonium sulfat secara bertingkat masing-masing dengan tiga fraksi, yaitu 0-40%, 40-60%, dan 60-80%. Berat molekul lipase ditentukan dengan SDS-PAGE dan zymogram. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford menggunakan bovin serum albumin (BSA) sebagai standar. Lipase hasil fraksinasi dikarakterisasi berdasarkan beberapa parameter seperti pH, temperatur, pengaruh ion logam, detergen dan inhibitor, serta efek pelarut organik. Aktivitas lipase diuji menggunakan substrat para nitrofenil palmitat (pNPP) dengan mengukur absorbansi senyawa para nitrofenol (pNP) yang dihasilkan dari proses katalisis pada panjang gelombang 405 nm. Aktivitas lipase dinyatakan dalam satuan unit/mg, yaitu μmol senyawa pNP (produk) yang dihasilkan oleh lipase per menit per mg enzim. Hasil penelitian menunjukkan koloni-koloni yang diperoleh sebagian besar dapat hidup pada media dengan kadar NaCl dari 5-27,5%, namun ada tiga koloni yang hanya mampu bertahan hidup pada kadar garam hingga 7,5%. Hasil uji potensi lipolitik menunjukkan ada satu koloni yang positif menghasilkan lipase, dimana koloni ini memiliki toleransi terhadap kadar NaCl dari 0-7,5% (termasuk halofilik rendah). Isolat tunggal dari koloni tersebut memiliki bentuk batang dan termasuk golongan bakteri gram negatif. Hasil konstruksi pohon filogentik menunjukkan kedekatan isolat dengan Pseudomonas stutzeri. Isolasi dan fraksinasi lipase dari isolat tunggal tersebut memberikan hasil terbaik pada fraksi 40-60% dengan aktivitas spesifik lipase sebesar 10,5 unit/mg untuk fraksinasi dengan aseton dan 12,8 unit/mg untuk fraksinasi menggunakan amonium sulfat. Hasil analisis SDSPAGE dan zymogram menunjukkan lipase yang diperoleh memiliki berat molekul 29 kDa. Lipase menunjukkan aktivitas optimum pada pH 8,5 dan temperatur 50 oC. Lipase masih stabil setelah diinkubasi selama satu jam pada temperatur 40 oC, dan mampu mempertahankan aktivitasnya hingga 74% setelah diinkubasi selama satu jam pada temperatur 50 oC. Aktivitas lipase meningkat dengan kehadiran ionion seperti Zn2+dan Ba2+, namun menurun oleh ion-ion seperti Cu2+ dan Fe2+. Inhibitor PMSF tidak signifikan menghambat aktivitas lipase yang menunjukkan kemungkinan enzim bukan termasuk golongan serin hidrolase. Lipase mampu mempertahankan aktivitasnya hingga 56% setelah diinkubasi selama 1 jam dalam 50 mM buffer Glisin-NaOH (pH 8,5) yang mengandung 10 mM EDTA, menunjukkan bahwa lipase tersebut tidak termasuk golongan metallo enzim. Hasil pengujian menunjukkan lipase stabil terhadap beberapa pelarut organik polar seperti methanol, etanol, dan aseton, serta pelarut organik non polar n-heksana, sehingga sangat potensial dikembangkan sebagai biokatalisator dalam reaksi sintesis organik. Dapat disimpulkan penelitian ini telah berhasil memperoleh varian lipase yang stabil terhadap pelarut organik dari bakteri halofilik yang diisolasi dari kawah lumpur “Bledug Kuwu”.