digilib@itb.ac.id +62 812 2508 8800

Membran plasma (MP) memisahkan sel dengan lingkungannya. Pada budding yeast S. cerevisiae, MP terkompartementasi membentuk mikro-kompartemen yang di antaranya adalah, MCC (microcompartment of Can1), MCP (microcompartment of Pma1) dan MCT (microcompartmentof target of rapamycin kinase 2). Pola distribusi ketiga mikro-kompartemen ini pada MP menunjukkan distribusi non-homogen yang membentuk punctae (MCC, MCT) atau distribusi homogen (MCP). Analisis terhadap MP ragi telah banyak dilakukan menggunakan confocal dan electron microscopy. Tujuan dari penelitian ini adalah mengembangkan reporter untuk menganalisis lokalisasi dari protein MP dan membandingkan hasil analisis confocal dan mikroskopi super resolusi (photoactivated light microscopy, PALM). C-terminus pada tiga MP protein yang berfungsi dalam sistem transport asam amino (Gap1, Bap2, dan Hip1) dapat berasosiasi dengan MP. Ketiga MP protein ini memiliki sekuens FWC (Phe-Trp-Cys) pada C-terminus (Bert Poolman, data belum dipublikasi). Penemuan ini digunakan sebagai basis untuk membuat reporter yang dapat digunakan pada PALM. Delapan transporter asam amino, yaitu Tat1, Tat2, Sam3, Agp1, dan Gnp1 memiliki sekuens FWC pada C-terminus dan satu di antaranya memiliki FFC sekuens pada C-terminus. Protein full-length dan C-terminus segmen dari proteinprotein tersebut difusikan dengan green fluorescent protein (GFP) pada Nterminus. Analisis PM menggunakan confocal microscopy menunjukkan bahwa konstruksi yang telah difusikan dengan GFP pada N-terminusnya terlokalisasi di PM. Penambahan FWC sekuens pada C-terminus dari PM protein mengasosiasikan segmen tersebut ke PM. Namun, penambahan FWC sekuens tidak mempengaruhi lokalisasi segmen C-terminus dari protein pada membran vakuola. Segmen C-terminus yang memiliki sekuens FWC membentuk lebih sedikit agregasi dan terlokalisasi lebih baik pada PM. Oleh karena itu, segmen Cterminus digunakan sebagai reporter untuk analisis PALM. Konstruksi gen yang telah dibuat difusikan dengan gen dari protein fluoresens (PSmOrange, mEos3.1, dan mEos3.2). Protein yang digunakan merupakan protein photoswitchable yang sesuai untuk digunakan pada PALM.Pertama-tama, dibandingkan lokalisasi darisegmen PSmOrange-C-terminus dengan PSmOrangeprotein full length. PSmOrange-Gap1 C-terminus dan PSmOrange-Can1 full length menunjukkan lokalisasi di inti sel dan tidak ter-fotoaktivasi pada PALM. Analisis confocal microscopy dari konstruksi tersebut menunjukkan tingkat ekspresi yang rendah setelah diinduksi oleh 0.2% galaktosa selama 2 jam. MEos3.1 dan mEos 3.2-Gap1C-terminus distribusi homogeny pada PM, sedangkan mEos3.1 dan mEos 3.2-Hip1C-terminus menunjukkan distribusi yang non-homogen dan membentuk punctae pada PM. PALM analisis menghasilkan lokalisasi dari molekul tunggal dengan resolusi mencapai 5 kali lebih tinggi dibangdingkan confocal microscopy.