digilib@itb.ac.id +62 812 2508 8800

2009 DIS PP HIRA HELWATI 1-COVER.pdf

File tidak tersedia

2009 DIS PP HIRA HELWATI 1-BAB 1.pdf
File tidak tersedia

2009 DIS PP HIRA HELWATI 1-BAB 2.pdf
File tidak tersedia

2009 DIS PP HIRA HELWATI 1-BAB 3.pdf
File tidak tersedia

2009 DIS PP HIRA HELWATI 1-BAB 4.pdf
File tidak tersedia

2009 DIS PP HIRA HELWATI 1-BAB 5.pdf
File tidak tersedia

2009 DIS PP HIRA HELWATI 1-PUSTAKA.pdf
File tidak tersedia

DNA polimerase I ITB-1 merupakan DNA Pol I dari Geobacillus thermoleovorans yang diisolasi dari sumber air panas Cimanggu, Jawa Barat. Gen DNA Pol I ITB-1 terdiri dari 2682 nukleotida yang mengkode 876 asam amino. Urutan deduksi asam amino DNA Pol I ITB-1 mempunyai homologi tinggi dengan DNA Pol I dari Bacillus caldotenax. Analisis homologi menyarankan bahwa DNA Pol I ITB-1 mempunyai urutan asam amino untuk domain exonuklease 5' -> 3', eksonuklease 3' -> 5' dan domain polimerase 5' -> 3'. Gen DNA Pol I ITB-1 telah diklon dan diekspresikan di Escherichia coli. Protein ekstrak kasar DNA Pol I ITB-1 menunjukkan aktivitas optimum pada 65oC (338K) dan pH 7,4. Studi awal untuk mempelajari struktur fungsi DNA Pol I ITB-1 telah dilakukan baik secara biokimia dengan pendekatan mutagenesis maupun secara komputasi dengan simulasi dinamika molekul. Namun demikian belum ada informasi mengenai kestabilan struktur masing-masing domain DNA Pol I ITB-1. Pada penelitian ini telah dilakukan studi kestabilan struktur DNA Pol I ITB-1 khususnya domain eksonuklease 3' -> 5' dan domain polimerase 5' -> 3' DNA secara komputasi dengan simulasi dinamika molekul dan kestabilan konformasi DNA Pol I ITB-1 serta mutan delesi secara eksperimen dengan analisis secara pektrofluorometri.Struktur tiga dimensi Klenow-like DNA Pol I ITB-1, domain eksonuklease 3' -> 5' dan domain polymerase 5' -> 3' yang diperoleh dari hasil pencerminan melalui Swiss-model (http://www.expasy.org/Swiss-Model) menyarankan kesamaan yang tinggi dengan struktur dari Bacillus Fragment (BF) terutama dengan Bacillus stearothermophylus. Klenow-like DNA Pol I ITB-1 terdiri dari dua domain, yaitu domain eksonuklease 3' -> 5' pada ujung N dan domain polimerase dan domain polimerase 5' -> 3' pada ujung C. Secara teoritis kedua domain dapat dipisahkan dari urutan asam amino pembentuknya. Secara eksperimen telah dikonstruksi mutan-mutan delesi dengan menghilangkan domain-domain tertentu dalam DNA Pol I ITB-1.Simulasi dinamika molekul pada 300K terhadap model Klenow-like DNA Pol I ITB-1, domain eksonuklease 3' -> 5' dan domain polmerase 5' -> 3' menyarankan bahwa ketiga model protein stabil pada 300K. Analisis RMSD-Ca membuktikan bahwa tidak ada perubahan struktur yang signifikan untuk ketiga protein pada 300K, hal ini didukung oleh hasil analisis perubahan struktur tersier (SASA) dan sekunder tidak menunjukkan perubahan berarti selama simulasi berlangsung (10ns) pada 300K. Pergerakan residu-residu asam amino selama simulasi memperlihatkan bahwa domain eksonuklease 3' -> 5' dan domain polimerase 5' -> 3 yang disimulasi secara terpisah mempunyai fluktuasi yang mirip dengan struktur Klenow-like DNA Pol I ITB-1. Hasil simulasi ini menyarankan bahwa domain eksonuklease 3' -> 5' dan domain polimerase 5' -> 3 stabil pada 300K.Hasil yang berbeda diperoleh dari analisis hasil simulasi ketiga protein pada temperatur yang lebih tinggi. Perubahan RMSD-Ca ketiga protein pada beberapa tingkatan temperatur simulasi menyarankan bahwa domain polimerase lebih tidak stabil daripada domain eksonuklease 3' -> 5' dan Klenow-like DNA Pol I ITB-1 yang diperlihatkan dengan perubahan RMSD yang tinggi dalam waktu yang lebih singkat serta fluktuasi residu-residu asam amino yang lebih tinggi dibandingkan dengan kedua model lainnya. Perbedaan nilai RMSD pada 360K dengan waktu simulasi lebih lama memperlihatkan bahwa fragmen Klenow-like DNA Pol I ITB-1 lebih stabil dari domain eksonuklease 3' -> 5' dan polimerase 5' -> 3. Hasil ini menyarankan bahwa domain-domain pada Klenow-like DNA Pol I ITB1 stabil temperatur ruang, tetapi pada temperatur tinggi kedua domain tidak stabil. Hal ini menyarankan bahwa DNA Pol I ITB-1 memerlukan kedua domain tersebut untuk mempertahankan kestabilannya pada temperatur tinggi.Secara eksperimen telah dikonstruksi mutan-mutan delesi DNA Pol I ITB-1 yang kehilangan salah satu domainnya. Mutan delesi EcoRI kehilangan sebagian domain polimerase sedangkan mutan delesi XhoI kehilangan domain eksonuklease 5' -> 3 dan eksonuklease 3' -> 5'. Sub kloning gen DNA Pol I ITB-1 dan kedua mutan delesi ke dalam vektor pET30a(+) telah berhasil dilakukan. Protein utuh Wild type dan mutan delesi EcoRI (domain eksonuklease) telah berhasil diekspresikan dan dimurnikan dengan matrik Ni-NTA.Analisis kestabilan konformasi struktur protein hasil ekspresi dengan metode spektrofluorometri berdasarkan pada sifat fluorosensi intrinsik residu triptofan dalam protein. DNA Pol I ITB-1 mempunyai 5 residu triptopan yang terdistribusi antara domain polimerase 5' -> 3 dan eksonuklease 3' -> 5' sedangkan domain eksonuklease 5' -> 3 tidak mempunyai residu triptofan. Analisis spektrum emisi fluorosensi pada berbagai pH menyarankan bahwa konformasi protein wild type dan mutan delesi EcoRI sangat dipengaruhi oleh pH lingkungannya. Protein WT mempunyai konformasi paling kompak pada pH 7,5 sedangkan mutan EcoRI paling kompak pada pH 7. Kekompakan struktur kedua protein turun drastis dengan berubahnya pH lingkungan baik menjadi asam atau basa. Analisis lain dengan menggunakan metode pemadaman intensitas fluorosensi pada pH 7,5, pH 4 dan pH 10 memberikan harga Ksv WT lebih besar dari pada delesi EcoRI, hal ini menyarankan bahwa kekompakan struktur DNA Pol I ITB-1 WT lebih rendah dibandingkan dengan protein delesi EcoRI. Namun demikian protein delesi EcoRI lebih sensitif terhadap perubahan pH lingkungannya. Studi stabilitas struktur domain polimerase yang diwakili oleh mutan delesi XhoI masih belum bisa dilakukan karena kendala dalam proses pemurnian protein hasil overekspresi.Hasil studi kestabilan struktur DNA Pol I ITB-1 dengan pendekatan secara komputasi dan eksperimen menyarankan bahwa domain polimerase 5' -> 3' dan domain eksonuklease 3' -> 5' DNA Pol I ITB-1 mempunyai peranan penting dalam kestabilan struktur protein secara keseluruhan terutama fragmen Kelnowlike DNA Pol I ITB-1. Analisis hasil simulasi menunjukkan struktur Klenow-like lebih stabil daripada kedua domainnya yang disimulasi terpisah pada temperatur tinggi dan protein WT secara eksperimen lebih tahan terhadap perubahan pH dari pada protein delesi EcoRI.