Perpustakaan Digital ITB

Produksi vektor adenovirus dipengaruhi oleh ekspresi transgen yang dapat menurunkan titer adenovirus hasil produksi. Penelitian sebelumnya telah mengembangkan genom adenovirus dengan modifikasi lacO, namun efektivitas sistem regulasinya belum terbukti. Salah satu dugaan penyebabnya adalah jumlah situs lacO yang terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk mengonstruksi genom adenovirus dengan sistem regulasi lac yang mengandung dua situs lacO, intron, dan Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) sebagai reporter gene untuk produksi adenovirus reporter. Plasmid pShuttle-LacO-Intron-EGFP dikonstruksi dengan menyisipkan EGFP dari plasmid pShuttle-CMV-EGFP ke situs MCS (Multiple Cloning Site) plasmid pShuttle-CMV-LacO melalui metode restriksi-ligasi. Keberhasilan konstruksi pShuttle-LacO-Intron-EGFP dikonfirmasi melalui analisis PCR EGFP yang menghasilkan pita berukuran 792 pb. Keberadaan dua situs lacO dan intron dikonfirmasi melalui sekuensing. Ekspresi EGFP dari plasmid pShuttle-LacO-Intron-EGFP diamati menggunakan Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) pada sel AD293 dengan dan tanpa ekspresi LacI. Sinyal EGFP terdeteksi pada sel AD293 tanpa LacI dan tidak terdeteksi pada sel AD293 yang mengekspresikan LacI. Plasmid pShuttle-LacO-Intron-EGFP dilinearisasi menggunakan PmeI, didefosforilasi, dan direaksikan dengan Taq polymerase. Plasmid linear direkombinasikan secara homolog dengan genom adenovirus pAdEasy melalui elektroporasi ke dalam Escherichia coli BJ5183-AD-1. Plasmid hasil rekombinasi diisolasi dari E. coli BJ5183 dan keberadaan intron dan hekson terkonfirmasi dengan analisis PCR. Plasmid pAdEasy-LacO-Intron-EGFP ditransformasi ke E. coli DH5? untuk penyimpanan, perbanyakan, dan karakterisasi lebih lanjut. Keberadaan EGFP, dua situs lacO, intron, dan hekson dikonfirmasi melalui analisis PCR menggunakan empat pasang primer spesifik. Keberhasilan rekombinasi dikonfirmasi melalui pemotongan dengan enzim PacI, menghasilkan pita berukuran 37735 pb dan 4719 pb yang mendekati ukuran teoretis. Hasil ini menunjukkan bahwa konstruksi genom adenovirus pAdEasy-LacO-Intron-EGFP berhasil dilakukan. Penelitian selanjutnya disarankan untuk melakukan uji ekspresi EGFP pada genom virus untuk mengevaluasi efektivitas sistem regulasi lac dalam meregulasi ekspresi transgen, serta menganalisis peran intron dalam peningkatan ekspresi.