Perpustakaan Digital ITB

Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1 dan Campylobacter jejuni masih menjadi ancaman signifikan bagi kesehatan unggas. Vaksin glikokonjugat multivalen yang secara simultan menargetkan H5N1 dan C. jejuni menawarkan strategi yang menjanjikan untuk perlindungan jangka panjang melalui induksi respons imun yang bergantung pada sel T. Protein Glycan Coupling Technology (PGCT) memungkinkan produksi vaksin tersebut melalui sintesis glikoprotein secara rekombinan di Escherichia coli dengan memanfaatkan sistem N-glikosilasi milik C. jejuni (lokus pgl). Hemaglutinin (HA), antigen permukaan utama H5N1, berfungsi sebagai protein pembawa yang sesuai untuk dikonjugasikan dengan N-glikan antigenik C. jejuni yang juga berlimpah. Namun, ekspresi HA di E. coli terhambat oleh banyaknya ikatan disulfida yang menyebabkan agregasi, karena E. coli memiliki kapasitas terbatas untuk mendukung pembentukan ikatan disulfida yang kompleks akibat lingkungan sitoplasmanya yang bersifat reduktif. Keterbatasan ini mengakibatkan rendahnya produksi protein dan efisiensi glikosilasi, mengingat glikosilasi yang dimediasi PGCT memerlukan protein yang larut dan telah ditranslokasikan ke ruang periplasmic. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan kelarutan dan N-glikosilasi protein HA H5N1 rekombinan yang terkonjugasi dengan N-glikan C. jejuni (rH5-GT) melalui evaluasi kombinasi strain E. coli dan peptida sinyal (SP), serta kondisi kultur. Dua kombinasi strain–peptida sinyal E. coli dievaluasi untuk mengarahkan HA melalui jalur translokasi dan lingkungan pelipatan yang berbeda, yaitu SCM6–PelB yang mendukung ekspor bergantung Sec dalam strain yang mendorong transfer N-glikan (?wecA, ?waaL), serta SHuffle-TorA yang memungkinkan pembentukan ikatan disulfida di sitoplasma (?gor, ?trxB, cdsbC) sebelum ekspor bergantung Tat. Selain itu, pengaruh penurunan suhu kultivasi (25°C dan 30°C) serta rentang konsentrasi IPTG (0-0,5 mM) dievaluasi untuk mengidentifikasi kondisi ekspresi yang mendukung produksi glikoprotein. Protein total, protein larut, dan protein terglikosilasi yang diekspresikan kemudian dianalisis menggunakan Western blot dengan antibodi primer anti-His tag (1:3000) dan lektin soybean agglutinin (SBA) (1:500). Hasil penelitian menunjukkan bahwa E. coli SHuffle-TorA hanya menghasilkan rH5 non-glikosilasi (~68,8 kDa), yang kemungkinan disebabkan oleh hambatan sterik pada situs glikosilasi ketika HA yang telah terlipat sempurna memasuki periplasma, sehingga menghalangi akses oligosakariltransferase (OTase) pglB. Sebaliknya, E. coli SCM6-PelB(SP) memungkinkan produksi rH5-GT (~84,4 kDa), yang menunjukkan bahwa translokasi dalam keadaan terlipat sebagian atau tidak terlipat sepenuhnya sangat penting untuk glikosilasi rH5-GT. Penurunan suhu inkubasi (25 °C) dengan durasi inkubasi yang sama (4 jam) menghasilkan peningkatan efisiensi glikosilasi sebesar ~2 kali lipat yang bersifat signifikan (P < 0,05; uji t Welch). Sementara itu, tidak diberikannya IPTG justru menghasilkan peningkatan efisiensi glikosilasi yang lebih signifikan (P < 0,01; uji t Welch) sebesar ~3 kali lipat, dengan tingkat protein total yang tetap serupa di seluruh kondisi. Hal ini menunjukkan bahwa ekspresi basal yang lambat memungkinkan pelipatan protein dan transfer glikan yang lebih baik. Secara keseluruhan, penelitian ini mengidentifikasi E. coli SCM6-PelB(SP) dengan jalur Sec, penurunan suhu, serta ekspresi basal tanpa IPTG sebagai parameter optimal untuk produksi rH5-GT dalam sistem PGCT.