Perpustakaan Digital ITB

Senyawa organofosfat sering digunakan dalam agrikultur sebagai pestisida atau insektisida untuk menghindari adanya hama dan meningkatkan produktivitas. Penggunaan organofosfat memiliki resiko yang tinggi karena sifatnya yang beracun. Organofosfat dapat bereaksi dengan sebuah enzirn yang berperan penting dalam sistem saraf, yaitu asetilkolinesterase. Asetilkolinesterase memiliki peran untuk menghidrolisis senyawa neurotransmiter bemarna asetilkolin sehingga sel­ sel otot dapat berelaksasi. Organofosfat dapat bereaksi secara ireversibel dengan residu katalitik asetilkolinesterase, sehingga enzim tersebut tidak lagi aktif. Salah satu cara untuk mengurangi residu organofosfat adalah bioremediasi menggunakan fosfatase, salah satunya dari subfamili haloasam dehalogenase. Haloasam dehalogenase (HAD) adalah kelompok enzim terbesar yang terdiri dari subfamili dehalogenase dan fosfatase. Meskipun namanya dehalogenase, sebagian besar enzim dalam famili HAD merupakan fosfatase. Enzim-enzim HAD sudah sering digunakan dalam bioremediasi, khususnya senyawa organohalogen. Klebsiella pneurnoniae sudah dilaporkan memiliki enzim HAD yang memiliki aktivitas dehalogenase. Namun, hasil pensejajaran urutan asam amino menunjukkan HAD milik K. pneumoniae memiliki motif yang dimiliki subfarnili fosfatase. Penelitian ini memiliki tujuan untuk mengeksplorasi kinetika dari enzim HAD yang dimiliki K. pneurnoniae. Koloni K. pneumoniae dikonfirmasi spesiesnya dengan ribosomal DNA typing. Gen 16S rRNA diamplifikasi dari DNA kromosom yang diisolasi dan dilakukan sequencing. Gen pengkode HAD dari K. pneumoniae (hakp2) diisolasi menggunakan PCR. Arnplifikasi hakp2 dilakukan menggunakan primer forward (5'-GAATTCATGATCCGCGCCATCGTG-3') dan reverse (5'­ AAGCTTTCATGCTGGGATCTGCTCC-3'). Fragrnen hasil PCR diklon ke pGEM-T dan ditransformasikan ke E. coli TOP 10 untuk diperbanyak dan disubklon ke pET-30a untuk diekspresikan menggunakan sistem ekspresi E. coli BL2 l(DE3). Plasmid pE T-hakp2 diisolasi dan dilakukan sequencing. Urutan nukleotida hakp2 digunakan untuk mendeduksi urutan asam amino Hakp2 dan memodelkan struktur 3Dnya. Hakp2 yang diproduksi dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas Ni­ NTA. Ni-NTA dapat digunakan untuk pemumian Hakp2 karena adanya his-tag yang dibawa. Residu-residu histidin akan terikat oleh ion Ni2+ yang ada pada resin NTA. Hakp2 yang telah dimumikan digunakan untuk menentukan parameter kinetika fosfatasenya. Hakp2 direaksikan dengan substrat p-nitrofenil fosfat (p­ NPP). Produk reaksi p-nitrofenol (p-NP) dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-vis dengan /... 405 nm. Struktur 3D yang dimodelkan berdasarkan urutan asam amino hasil deduksi digunakan untuk melakukan studi komputasi. Studi komputasi dilakukan untuk menguji stabilitas substrat di dalam situs katalitik Hakp2. Molekul p-NPP ditambatkan (docking) ke dalam situs katalitik Hakp2 dan dilakukan simulasi dinamika molekul (MD). Hasil analisis spesies menggunakan ribosomal typing menunjukkan koloni memiliki kedekatan yang sangat tinggi dengan Klebsiella pneumoniae dengan persen identitas sebesar 99,41%. Penentuan urutan nukleotida hakp2 menunjukkan ukuran gen tersebut adalah 690 pasang basa. Hakp2 memiliki berat molekul 31,21 kDa berdasarkan deduksi dari urutan nukleotida. Hakp2 membawa his-tag, S-tag, enterokinase site, dan thrombin site. Hakp2 memiliki KM sebesar 3,7128 mM, Vmax sebesar 8,42 nM/detik, dan kcat sebesar 0,01315 detik1 Sebagai perbandingan fosfatase dari Arthrobacter sp. dan A=ohydromonas australica memiliki kcat sebesar 4.540 detik-1 dan 4,6 detik 1 Mekanisme defosforilasi membutuhkan dua residu aspartat, sedangkan Hakp2 memiliki residu aspartat dan glutamat. Studi komputasi dari mutan Hakp2 ElOD yang mengubah glutamat tersebut menjadi aspartat menunjukkan perbedaan struktur pada saat adanya substrat pada situs katalitik. Berubahnya glutamat menjadi aspartat juga menurunkan nilai energi bebas pengikatan substrat (MM­ GBSA) yang menunjukkan pengikatan substrat yang lebih kuat.