Perpustakaan Digital ITB

Protein Ml Streptococcus pyogenes memiliki beberapa daerah yang diduga memiliki peran dalam aktivitas pengikatan fibronektin, diantaranya adalah daerah d yang terdapat pada fragmen ABS protein Ml. Untuk mengetahui apakah daerah tersebut berperan dalam pengikatan fibronektin, maka dilakukan rekayasa pada daerah d fragmen tersebut. Asam amino bermuatan pada daerah d diubah menjadi alanin yang merupakan asam amino yang tidak bermuatan. Pengubahan ini dilakukan pada tingkat nukleotida menggunakan mutagenesis terarah dengan metode PCR. pETl6abs yang diisolasi dari Escherichia coli BL2l digunakan sebagai cetakan. Berdasarkan analisis migrasi diketahui bahwa pETl6abs cetakan telah mengalami dimerisasi. Cetakan yang berbentuk dimer akan menyebabkan masalah dalam spesifikasi penempelan primer dan waktu pemanjangan selama proses PCR, oleh karena itu dilakukan perbaikan pETl6abs untuk diperoleh plasmid monomer. Perbaikan pETl6abs menjadi monomer telah berhasil dilakukan di E. coli DH5 . Plasmid monomer ini digunakan sebagai cetakan dalam mutagenesis terarah dengan variasi suhu penempelan primer, yaitu 4O OC, 55 OC, dan 66 OC. Pada kondisi ini, mutan daerah d fragmen ABS protein Ml belum berhasil dikonstruksi. Mutagenesis terarah pada penelitian ini sulit dilakukan karena jumlah nukleotida yang harus diubah cukup banyak, yaitu 9 nukleotida. Hal tersebut menyebabkan primer sulit menempel dengan baik pada cetakan. Oleh karena itu, mutagenesis terarah disarankan untuk dilakukan dalam dua tahap menggunakan dua pasang primer berbeda. Kedua pasang primer tersebut telah dirancang menggunakan program DNASTAR dengan masing-masing pasangan primer hanya mengandung 4 dan 5 nukleotida yang diubah.