Perpustakaan Digital ITB

Senyawa organohalogen telah dimanfaatkan secara meluas sebagai pestisida, herbisida, dan pelarut dalam industri. Penggunaan senyawa organohalogen secara luas serta sifatnya yang beracun dan tidak mudah terurai mengakibatkan penumpukan senyawa tersebut di lingkungan sebagai polutan. Banyak penelitian telah melaporkan bahwa terdapat banyak mikroorganisme, terutama bakteri, yang mampu mendegradasi senyawa organohalogen dan mengubahnya menjadi senyawa yang tidak beracun dan aman bagi lingkungan. Salah satu metode yang banyak dikembangkan untuk mengatasi dampak negatif dari senyawa organohalogen dikenal dengan teknik bioremediasi. Bioremediasi pada umumnya memanfaatkan kemampuan dari mikroorganisme dalam mengatasi permasalahan lingkungan. Kemampuan degradasi organohalogen dimiliki oleh bakteri dikarenakan bakteri tersebut dapat menghasilkan suatu enzim yang dinamakan dehalogenase. Dehalogenase merupakan enzim yang mengkatalisis pemutusan ikatan antara atom halogen dari senyawa induknya. Penelitian sebelumnya telah memberikan data bahwa Pseudomonas aeruginosa strain lokal dari Indonesia memiliki kemampuan dalam mendegradasi asam monokloroasetat. Gen yang mengkode haloacid dehalogenase berukuran 702 bp, disebut sebagai paed-d, telah berhasil diklon ke vektor pGEM-T dalam sel inang E. coli TOP10. Penelitian ini difokuskan untuk subkloning gen paed-d ke vektor ekspresi pET-30a(+) dalam E. coli BL21 (DE3). Primer maju dengan sisi pengenalan restriksi EcoRI, GAATTC, dan primer mundur dengan sisi pengenalan restriksi HindIII, AAGCTT, digunakan pada proses PCR untuk menghasilkan fragmen yang akan disubklon dengan orientasi ekspresi yang benar. Ururtan primer maju yang digunakan adalah 5’- GAATTCATGCGCGCGATCCTGTTCGA-3’ sedangkan untuk primer mundur adalah 5’-AAGCTTTCAGGCCGAGGCCGCCAGTT-3’. Amplikon yang diperoleh diklon ke pGEM-T, ditransformasi ke E. coli TOP10, dikonfirmasi melalui rePCR dan anlisis restriksi, disubklon ke pET-30a(+), dan ditransformasi ke E. coli BL21 (DE3). Penggunaan primer ini telah berhasil memberikan amplikon berukuran ~750 bp. Analisis restriksi dan rePCR mengkonfirmasi bahwa amplikon tersebut adalah paed-d. Amplikon ini telah berhasil disubklon ke vektor ekspresi pET-30a(+) dalam E. coli BL21 (DE3). Hasil penjajaran antara gen paedd hasil subkloning dengan gen paed-d penelitian sebelumnya menunjukkan kesamaan 100%. Overekspresi haloacid dehalogenase berdasarkan pengamatan pada SDS-PAGE telah berhasil diperoleh dan terkonsentrasi pada debris sebagai inclusion body. Ekspresi gen paed-d hasil rekombinan dengan IPTG sebagai induser dianalisis dalam SDS-PAGE memberikan hasil terbaik pada konsentrasi IPTG 0,01 mM dan suhu induksi 4 oC dengan ukuran protein sekitar 26 kD. Hasil ini diperkuat oleh prediksi ukuran haloacid dehalogenase melalui Expacy Protparam yang memberikan prediksi berat molekul haloacid dehalogenase dari gen paed-d sebesar 26,352 kDa. Prediksi struktur tersier haloacid dehalogenase Pseudomonas aeruginosa strain lokal berupa lipatan ?-sheet yang diapit oleh ?- heliks. Analisa in silico memberikan jumlah residu 233 asam amino dengan prediksi residu katalitik aspartat pada posisi residu nomor tujuh (Asp7)