Perpustakaan Digital ITB

Bacillus aquimaris MKSC 6.2 (B. aquimaris) merupakan bakteri Gram positif yang diisolasi dari koral lunak Sinularia sp. di perairan Merak, Indonesia. Bakteri ini diketahui menghasilkan α-amilase yang khas, yakni dapat mendegradasi pati mentah tanpa adanya starch binding domain (SBD), yang umumnya dimiliki oleh enzim pendegradasi pati mentah. Berdasarkan penemuan tersebut, bakteri ini diharapkan memiliki gen katG pengode katalase-peroksidase (KatG) dengan struktur dan fungsi yang unik. Enzim KatG memiliki dua aktivitas katalitik yang berbeda dari satu sisi aktif enzim, yakni katalase dan peroksidase. Saat ini penggunaan KatG di industri sudah cukup luas, mulai dari industri makanan hingga industri tekstil. Dalam dunia medis KatG juga dikembangkan sebagai pengaktif obat anti-tuberkulosis. Oleh karena itu, KatG dari B. aquimaris MKSC 6.2 memiliki potensi yang besar untuk banyak aplikasi dalam kehidupan sehari-hari. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi dan mengekspresikan gen katG utuh dari B. aquimaris MKSC 6.2 (katG-Baq). Proses isolasi gen katG-Baq menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan dua pendekatan, yakni degenerate-PCR dan PCR terbalik. Pada penelitian pendahuluan, potongan fragmen gen katG-Baq (katG-x) berukuran 1385 pb telah berhasil diamplifikasi dengan teknik degenerate-PCR. Mengacu pada referensi, fragmen katG-x yang diperoleh hanya mencakup 63% dari ukuran gen katG-Baq (2,2 kb). Oleh karena itu, primer FD dan RD selanjutnya dirancang untuk reaksi PCR terbalik dengan tujuan mengamplifikasi fragmen gen katG-Baq yang belum diidentifikasi. Amplikon hasil PCR terbalik dianalisis dengan sekuensing, kemudian urutan nukleotidanya disejajarkan dan digabungkan dengan fragmen katG-x menggunakan program Seqman (DNASTAR). Urutan nukleotida dari kedua amplikon saling overlapping dan saling melengkapi satu sama lain hingga akhirnya dapat diperoleh urutan nukleotida gen katG-Baq yang lengkap. Berdasarkan hasil tersebut, primer 30F dan 30R selanjutnya dirancang untuk mengamplifikasi gen katG-Baq secara utuh. Agar gen katG-Baq dapat dikonstruksi ke vektor pET-30a, pada primer 30F ditambahkan sisi restriksi NdeI dan pada primer 30R ditambahkan sisi restriksi BglII. Gen katG-Baq hasil PCR dengan primer 30F-30R diligasi ke vektor pGEM-T untuk mentransformasi E. coli TOP 10. Sel transforman berhasil dikonfirmasi dengan PCR koloni, namun hasil analisis restriksi tidak sesuai dengan teori. Berdasarkan analisis hasil sekuensing, di dalam Open Reading Frame (ORF) gen katG-Baq terdapat sisi restriksi NdeI. Oleh karena itu, satu nukleotida yang dikenali ii NdeI tersebut diubah dengan teknik Site Directed Mutagenesis-PCR (SDM-PCR) sehingga tidak dapat dipotong oleh enzim restriksi NdeI. Gen katG-Baq mutan yang telah dikonfirmasi dengan analisis restriksi selanjutnya disubkloning ke vektor pET-30a. Rekombinan pET-30a-katG divalidasi dengan PCR koloni, kemudian gen katG-Baq diekspresikan dalam E. coli BL21 DE3. Hasil analisis filogenetik dan BLAST (NCBI) urutan asam amino menunjukkan bahwa KatG B. aquimaris MKSC 6.2 memiliki kekerabatan yang sangat dekat dengan KatG dari B. aquimaris strain lain (Genbank ID: WP_032085868.1) dan B. enclensis (Genbank ID:WP058298862.1), dengan persen homologi antara spesies tersebut mencapai 96%. Adanya perbedaan urutan asam amino sekitar 4% berimplikasi pada karakteristik KatG B. aquimaris MKSC 6.2. yang unik.