Teks ini menjelaskan metodologi penelitian yang dilaksanakan mulai Agustus hingga Maret 2024 di Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler, SITH, ITB, mengikuti diagram rancangan yang spesifik. **Alat dan Bahan:** Penelitian ini menggunakan berbagai alat laboratorium standar dan spesifik (seperti spektrofotometer UV-Vis, PCR thermocycler, elektroforesis, glomax discover system), serta bahan dan reagen penting, termasuk stok gliserol *E. coli* Origami B DE3, medium LB, antibiotik (tetrasiklin, kanamisin, ampisilin), IPTG sebagai induser, dan p-nitrophenyl butyrate (pNPB) sebagai substrat uji aktivitas. **Prosedur Penelitian meliputi:** 1. **Isolasi Plasmid pET22b-PETase Mutan:** Plasmid yang mengandung gen PETase mutan diisolasi menggunakan kit komersial, kemudian diukur konsentrasi, kemurnian, dan divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa. 2. **Pembuatan Sel Kompeten dan Transformasi Plasmid:** Sel kompeten *E. coli* Origami B DE3 dibuat menggunakan buffer CCMB80, diikuti dengan transformasi plasmid pET22b-PETase mutan melalui metode *heat shock*. Koloni transforman diseleksi pada medium LB yang mengandung antibiotik. 3. **Konfirmasi Hasil Transformasi:** Dilakukan dengan PCR koloni menggunakan primer T7 dan divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa, serta sekuensing DNA metode Sanger (menggunakan primer T7 promotor dan terminator) yang datanya dianalisis menggunakan BioEdit dan EMBOSS Water. 4. **Pembuatan Kurva Tumbuh:** Dilakukan untuk *E. coli* transforman dan nontransforman untuk menentukan fase pertumbuhan optimum (early, mid, late log) untuk induksi IPTG, dengan memantau OD600 secara berkala. 5. **Produksi PETase Mutan:** Proses ini dioptimasi pada titik induksi (berdasarkan fase pertumbuhan terbaik dari kurva tumbuh) dan waktu induksi (12, 18, dan 24 jam). Protein PETase dipanen dalam fraksi ekstraseluler, intraseluler soluble, dan intraseluler insoluble. 6. **SDS-PAGE:** Analisis visualisasi dan kuantifikasi protein PETase mutan dilakukan dengan SDS-PAGE 10%, diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue, dan divisualisasi menggunakan Geldoc serta ImageJ. 7. **Uji Aktivitas:** Aktivitas PETase mutan diukur secara kolorimetri terhadap substrat pNPB pada suhu 40°C menggunakan 96-well microtiter plate dan Glomax Discover System untuk mengukur absorbansi A400nm, kemudian dihitung nilai aktivitasnya menggunakan rumus spesifik. **Analisis Data:** Data SDS-PAGE dikuantifikasi menggunakan ImageJ. Data uji aktivitas PETase diolah secara statistik menggunakan IBM SPSS versi 25.0 (meliputi uji normalitas Shapiro-Wilk, homogenitas Levene, dilanjutkan t-test/ANOVA atau Mann-Whitney/Tukey tergantung distribusi data) dan divisualisasi dengan Microsoft Excel.