Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kadar laktosa dalam susu formula bayi (SFB) menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan kolom NH2 sebagai fase diam dan elusi isokratik asetonitril dan air sebagai fase gerak. Komposisi fase gerak mempengaruhi waktu retensi laktosa, dengan semakin banyak asetonitril memperlama waktu retensi. Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan efektivitas sistem, meliputi keberulangan penyuntikan, faktor selektivitas, faktor ikutan, dan resolusi, yang hasilnya memenuhi persyaratan. Validasi metode dilakukan untuk memastikan parameter validasi memenuhi persyaratan, menunjukkan kurva kalibrasi linier lebih cocok dibandingkan kuadratik. Penentuan kadar laktosa dalam sampel SFB dilakukan dengan tiga prosedur preparasi yang berbeda, dengan prosedur III (menggunakan asam oksalat dan etanol) memberikan hasil yang paling akurat dan seksama. Kadar laktosa yang ditemukan pada sampel SFB kemudian dibandingkan dengan yang tercantum pada kemasan.