Teks ini membahas preparasi, karakterisasi, optimasi produksi, dan analisis hidrolisat protein dari biji kenari (*Canarium indicum L.*) defatted, dengan fokus pada potensi bioaktifnya sebagai antioksidan. **1. Preparasi dan Karakterisasi Biji Kenari Defatted:** Pemanfaatan produk samping biji kenari berupa bungkil defatted dari produksi minyak masih terbatas, padahal biji kenari memiliki kandungan lemak 67,5% dan protein yang signifikan. Biji kenari utuh (*nut in testa*) diproses melalui pemanasan, pengupasan, dan pengepresan untuk menghasilkan serbuk biji kenari defatted. Proses ini secara signifikan meningkatkan kadar protein dari 12,6% menjadi 36,0% dan kadar abu, sementara menurunkan kadar lemak, serat, dan karbohidrat. Identitas bahan baku dikonfirmasi sebagai *Canarium indicum Linn.* **2. Ekstraksi Protein:** Protein diekstrak dari biji kenari defatted menggunakan metode homogenisasi dengan dapar pada pH 7 (untuk papain dan flavourzyme) atau pH 2 (untuk pepsin). Hasil ekstrak berupa cairan seperti susu dengan kadar protein 43,246 mg/mL. Analisis SDS-PAGE mengidentifikasi 7 pita protein (8,873-79,385 kDa), namun hanya 3 jenis protein yang teridentifikasi dalam database UniProt untuk spesies ini, menunjukkan eksplorasi protein kenari yang masih terbatas. **3. Optimasi Produksi dan Karakterisasi Hidrolisat Protein:** Hidrolisis protein dioptimasi menggunakan tiga protease: papain, flavourzyme, dan pepsin, dengan metode Response Surface Methodology (RSM) untuk menemukan kondisi optimum yang menghasilkan aktivitas antioksidan terbaik. * **Kadar Protein:** Hidrolisat protein memiliki kadar protein lebih rendah daripada ekstrak awal (karena denaturasi dan sentrifugasi). Papain menghasilkan kadar protein tertinggi (21,8-38,3 mg/mL), secara signifikan berbeda dari flavourzyme dan pepsin. Konsentrasi enzim-substrat (ES) adalah faktor paling signifikan. * **Derajat Hidrolisis (DH):** Pepsin menghasilkan DH terendah (1,3-3,8%), sedangkan papain dan flavourzyme menghasilkan DH yang lebih tinggi (4,1-23,1% dan 3,6-22,7%). Konsentrasi ES, waktu, dan suhu hidrolisis secara signifikan mempengaruhi DH untuk papain dan flavourzyme, sementara untuk pepsin, interaksi waktu dan ES yang signifikan. * **Aktivitas Antioksidan:** Aktivitas antioksidan (ditetapkan dengan metode DPPH, diukur sebagai IC50) digunakan sebagai parameter optimasi. Hidrolisat yang diproduksi dengan pepsin menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi (IC50 terendah) yaitu 0,195 mg/mL (sampel C14), bahkan sebanding dengan vitamin C, meskipun secara umum dikategorikan sebagai antioksidan lemah. Konsentrasi ES dan suhu hidrolisis merupakan faktor yang berpengaruh signifikan. Sampel C14 dipilih untuk analisis lebih lanjut. * **Profil Elektroforesis:** Profil SDS-PAGE hidrolisat menunjukkan bahwa protease aktif memecah protein menjadi fragmen peptida dengan bobot molekul lebih rendah (tidak ada protein >35 kDa), dengan papain menghasilkan fragmen terkecil. **4. Analisis Hidrolisat Protein Terpilih (Sampel C14):** Sampel C14 (hidrolisat pepsin dengan aktivitas antioksidan tertinggi) dianalisis lebih lanjut. * **Komposisi Asam Amino:** Analisis LC-MS/MS menunjukkan hidrolisat protein kaya akan Arginin (dominan), Leusin, Isoleusin, Valin, Histidin, dan Sistein. Komposisi ini berbeda dari biji kenari utuh yang didominasi asam glutamat. Hidrolisat ini mengandung asam amino esensial dan kondisional esensial. Asam amino ini berpotensi untuk berbagai aplikasi, seperti penambah rasa, pelepas hormon, prekursor oksida nitrat, antioksidan, komponen farmasi/kosmetik, dan suplementasi untuk kesehatan otot, metabolisme glukosa, dan fungsi hati. * **Identifikasi Peptida:** UHPLC-HRMS mengidentifikasi 22 peptida (6-20 asam amino), sebagian besar berasal dari protein *Canarium indicum* dan spesies *Canarium* terkait. Peptida ini didominasi oleh asam amino Leusin, Alanin, Treonin, dan Glisin. Struktur peptida (misalnya, keberadaan asam amino hidrofobik atau aromatik pada N-terminal, bobot molekul rendah