19 Bab IV Percobaan IV.1 Alat, Bahan dan Mikroba Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi inkubator (Leoueux, Paris), inkubator goyang (GSL), autoklaf (OMRON Corporation), laminar air flow cabinet (Microflow), alat elektroforesis poliakrilamid (Bio Rad ® ), lemari pendingin -20 ºC (Denpoo), pemanas listrik (Cobusto), mikropipet (Eppendorf), tip mikropipet (Axygen), oven (LTE, Ltd.), sentrifuga (Sorvall, Legend Micro 17 centrifuge), sentrifuga (Mikro200R zentrifugen Hettich), sentrifuga (Allegra ® X- 15R), tabung mikrosentrifuga 1,5 mL dan 200 μL (Eppendorf), membran dialisis cut off 2 kDa, Nanosep ® cut off 10 kDa, timbangan elektrik (Sartorius BP3105), vorteks (Barnstead, Thermolyne), magnetic stirrer, spektrofotometer sinar tampak (Beckman), pH meter, mikroskop cahaya (Olympus), kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor indeks refraksi (Hitachi D-2000 RI-Detector L-2490, Pump HT A L-2130, Jepang) dan kolom KCKT (Waters Spherisorb ® NH2 Column, 5 µm, 4,6 x 250 mm, Irlandia). Bahan-bahan yang digunakan untuk penelitian ini meliputi: media Horikoshi {1% (b/v) pati kentang (soluble starch), 0,5% (b/v) pepton, 0,5% (b/v) yeast extract, 0,02% (b/v) MgSO4.7H2O, 0,1% (b/v) K2HPO4, 1% (b/v) Na2CO3, 0,03% (b/v) fenolftalin, dan 0,01% (b/v) jingga metil} (Park dkk, 1989); media uji fermentasi gula {0,5 g/L gula (glukosa, xilosa, arabinosa, manitol, laktosa, maltosa, sakarosa), 10 g/L pepton, 5 g/L natrium klorida, dan 0,018 g/L indikator merah fenol}; media uji IMVIC; pereaksi Kovac’s; pereaksi Barrit’s; indikator warna merah metil; media Lysine Iron Agar (LIA); media Triple Sugar Iron Agar (TSIA); pewarna biru metilen; pewarna karbol Fuchsin; minyak imersi; amonium sulfat (Merck); dapar Tris-Cl; dapar Na-asetat; dapar Na-fosfat; dapar glisin- NaOH; HCl; NaOH; bahan-bahan yang digunakan untuk SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) yang teridiri dari dapar elektroforesis {basa Tris (Promega), glisin (Promega) dan sodium dodecyl sulphate (SDS, Promega)}; marker protein unstain (Amersham); dapar sampel (1,0 M Tris-Cl pH 6,8, gliserol, SDS, 2-merkaptoetanol dan biru bromofenol); akrilamid 29,2%, bis-akrilamid 20 0,8%, separating gel buffer denaturing (1,5 M Tris-Cl pH 8,8 dan SDS 10%), stacking gel buffer denaturing (1,0 M Tris-Cl pH 6,8 dan SDS 10%), SDS 10%, amonium persulfat (APS) 10%, dan tetrametiletilendiamin (TEMED); bahan- bahan yang digunakan untuk PAGE-natif/nondenaturing yang terdiri dari dapar elektroforesis (basa Tris dan glisin); dapar sampel (Tris-Cl pH 6,8, gliserol dan biru bromofenol); akrilamid 29,2%, bis-akrilamid 0,8%, separating buffer nondenaturing (1,5 M Tris-Cl pH 8,8), stacking buffer nondenaturing (1,0 M Tris- Cl pH 6,8), amonium persulfat (APS) 10%, dan tetrametiletilendiamin (TEMED); larutan staining (coomassie blue, metanol dan asam asetat glasial); larutan destaining (metanol dan asam asetat glasial); pereaksi Bradford (Bio Rad ® ); Na2CO3; fenolftalin; etanol; agarosa; kalium iodida (KI); iodin (I2); CD-α, β dan γ (Nacalai Tesque, Jepang); aquadestillata; aquabidestillata; air deion dan asetonitril (JT Baker). Mikroba yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat Bacillus sp. LT1B dan PT2B dari Laboratorium Bioteknologi Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung. IV.2 Pewarnaan Isolat LT1B dan PT2B Pewarnaan isolat LT1B dan PT2B yang dilakukan meliputi pewarnaan sederhana dan pewarnaan endospora. Untuk pewarnaan sederhana, sebanyak 1 Öse biakan LT1B dan PT2B dari media agar Horikoshi disuspensikan dalam setengah tetes NaCl 0,9% steril pada permukaan kaca obyek bersih. Preparat difiksasi dengan pemanasan, kemudian dituangi dengan pewarna biru metilen 0,3% (b/v) dan dibiarkan selama 2 menit. Sisa biru metilen yang tidak terikat dibuang dan preparat dibilas perlahan dengan air mengalir kecil. Preparat dikeringkan dengan mengangin-anginkannya di udara dan dituangi dengan minyak imersi. Preparat diamati dengan mikroskop cahaya menggunakan lensa obyektif perbesaran 100x (Cappucino dan Shermann, 2008). Pewarnaan endospora dilakukan menggunakan modifikasi dari metode pewarnaan Ziehl-Neelsen (Cappucino dan Shermann, 2008). Sebanyak satu Öse biakan 21 bakteri LT1B dan PT2B berumur 48 jam dari media Horikoshi padat disuspensikan dalam 0,5 mL larutan karbol Fuchsin Ziehl’s di dalam satu tabung reaksi bersih. Kemudian tabung dipanaskan perlahan di atas nyala api Bunsen hingga hampir mendidih. Satu Öse suspensi tersebut disebar-ratakan di atas kaca obyek bersih, difiksasi dan ditetesi larutan biru metilen 0,3% (b/v) hingga seluruhnya terbasahi dan dibiarkan selama 5 menit. Prosedur selanjutnya dilakukan seperti pada pewarnaan sederhana. Spora akan tampak berwarna merah dan sel berwarna biru transparan. IV.3 Uji Biokimia Uji biokimia yang dilakukan meliputi uji fermentasi gula, IMVIC dan produksi H2S. Untuk uji fermentasi gula, sebanyak 1 Öse biakan LT1B dan PT2B dari media Horikoshi padat diinokulasikan ke dalam 5 mL media fermentasi gula (glukosa, arabinosa, xilosa, manitol, sakarosa dan laktosa) pada tabung reaksi yang di dalamnya terdapat tabung Durham terbalik. Biakan diinkubasi selama 16- 18 jam pada 37 °C. Hasil fermentasi berupa asam ditunjukkan dengan berubahnya warna media dari jingga menjadi kuning, sedangkan adanya gas ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung udara di dalam tabung Durham (Cappucino dan Shermann, 2008).