PRODUKSI DAN KARAKTERISASI POLIHIDROKSIBUTIRAT (PHB) DARI GALUR LOKAL Halomonas elongata BK-AG25 DAN OPTIMASINYA MELALUI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DISERTASI Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari Institut Teknologi Bandung Oleh WA ODE SRI RIZKI NIM: 30520301 (Program Studi Doktor Kimia) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Oktober 2024 i ABSTRAK PRODUKSI DAN KARAKTERISASI POLIHIDROKSIBUTIRAT (PHB) DARI GALUR LOKAL Halomonas elongata BK-AG25 DAN OPTIMASINYA MELALUI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Oleh Wa Ode Sri Rizki NIM: 30520301 (Program Studi Doktor Kimia) Kemajuan ekonomi dan pertumbuhan populasi manusia tidak terhindarkan dari peningkatan komoditas dan perubahan gaya hidup yang secara tidak langsung berdampak pada peningkatan permintaan dan produksi plastik. Plastik yang umum digunakan masyarakat saat ini, merupakan plastik yang berbahan dasar minyak bumi, sulit terdegradasi secara alami, sehingga menyebabkan penumpukan sampah plastik di lingkungan. Sampah plastik menimbulkan polusi dan permasalahan mikroplastik bagi organisme hidup. Untuk mengatasi masalah ini, maka diperlukan adanya inovasi baru yang ramah lingkungan. Bioplastik adalah biopolimer hayati yang merupakan plastik lebih ramah lingkungan dibandingkan plastik berbahan dasar minyak bumi. Penggunaan bioplastik akan mengurangi kebergantungan pada minyak bumi dan mendukung ekonomi sirkular karena bioplastik mudah terdegradasi untuk menghasilkan elemen yang mendukung pertumbuhan mikroba dan tanaman, yang pada akhirnya dapat menghasilkan bioplastik kembali. Polihidroksibutirat (PHB) merupakan salah satu jenis bioplastik yang dihasilkan oleh bakteri. Salah satu keunggulan PHB dibandingkan jenis bioplastik lainnya adalah kemudahan dan kecepatannya untuk terurai secara biologis saat berinteraksi dengan mikroorganisme di lingkungan. Dalam beberapa tahun terakhir, minat terhadap PHB meningkat secara signifikan karena sifatnya yang mirip dengan plastik dari minyak bumi, seperti polipropilena. Namun, secara komersial produksi PHB masih terkendala oleh efisiensi produksi yang rendah, biaya produksi yang tinggi, dan proses hilirisasi yang rumit. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimasi produksi PHB dari dua bakteri lokal dan meningkatkan produksi PHB dengan memanfaatkan teknologi DNA rekombinan menggunakan sistem satu plasmid dan dua plasmid dalam sel inang Escherichia coli. Pada penelitian ini, hasil penapisan menggunakan Nile red menunjukkan bahwa H. elongata BK-AG25 dan Salinivibrio sp. merupakan bakteri bakteri potensial dalam memproduksi PHB. PHB yang dihasilkan telah dianalisis menggunakan FT-IR. Dalam high medium (HM), kedua bakteri menghasilkan PHB intrasel dengan kadar rendah, yang kemudian dioptimasi melalui pendekatan single factor. Hasil optimasi ii menunjukkan bahwa H. elongata BK-AG25 dengan 2,33±0,12 g/L biomassa menghasilkan kadar PHB tertinggi sebesar 74±4% (b/b) dalam HM yang mengandung 0,2% (b/v) ekstrak ragi dan 5% (b/v) NaCl, setelah inkubasi 72 jam. Sementara itu, dalam HM yang mengandung 15% (v/v) limbah kelapa sawit (POME), 5% (b/v) NaCl, 0,1% (b/v) ekstrak ragi, dan 0,1% (b/v) ammonium sulfat, Salinivibrio sp. memiliki 0,17±0,01 g/L biomassa yang menghasilkan kadar PHB tertinggi sebesar 63±6% (b/b). Pada kondisi ini, masing-masing H. elongata BK- AG25 dan Salinivibrio sp. memproduksi PHB 3,5 dan 21,6 kali lebih besar dibandingkan produksinya dalam HM normal. PHB yang diproduksi oleh kedua bakteri memiliki morfologi berbentuk lembaran. PHB yang dihasilkan oleh H. elongata BK-AG25 telah dianalisis menggunakan 1 H NMR, sedangkan PHB yang dihasilkan oleh Salinivibrio sp. tidak dapat dianalisis menggunakan 1 H NMR karena memiliki kemurnian yang rendah akibat penggunaan POME sebagai sumber karbon. Analisis kestabilan termal terhadap PHB yang dihasilkan oleh H. elongata BK-AG25 menunjukkan 91% dekomposisi pada 263 °C, sedangkan PHB yang dihasilkan oleh Salinivibrio sp. hanya terdekomposisi 74% pada 285 °C. Hasil ini mendukung rendahnya kemurnian PHB yang diproduksi oleh Salinivibrio sp. meskipun proses pemurnian telah diupayakan dengan maksimal. Hasil analisis komposisi atom menggunakan EDS terhadap PHB yang diproduksi oleh Salinivibrio sp. menunjukkan adanya atom Na dan Cl, memperkuat rendahnya kemurnian pada PHB yang diproduksi oleh Salinivibrio sp. Oleh sebab itu, H. elongata BK-AG25 dipilih untuk penelitian selanjutnya dalam upaya peningkatan produksi PHB melalui pendekatan teknologi DNA rekombinan. Gen phbA, phbB, dan phbC yang berperan dalam biosintesis PHB pada H. elongata BK-AG25 telah berhasil diisolasi menggunakan pendekatan PCR. Gen-gen tersebut telah ditentukan urutannya dan hasil analisis bioinformatika memberikan urutan palindrom pengenalan enzim restriksi yang dapat disisipkan pada kedua ujung masing-masing gen untuk membuat sistem operon ekspresi pada satu plasmid (pET-phbABC) dan dua plasmid (pET-phbC/pET-phbAB). Gen phbA, phbB, dan phbC dari H. elongata BK-AG25 ini memiliki ukuran 1211, 747, dan 1813 pb. Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa ketiga gen dalam sistem satu dan dua plasmid memberikan ekspresi yang sama, yakni menghasilkan protein PhbA, PhbB, dan PhbC yang memiliki ukuran 26, 43, dan 68 kDa. Dalam medium LB yang mengandung 2% (b/v) glukosa, rekombinan E. coli BL21(DE3)/pET-phbABC memberikan 1,98±0,08 g/L biomassa yang menghasilkan kadar PHB tertinggi sebesar 81±21% (b/b) setelah inkubasi 48 jam. Sementara itu, rekombinan E. coli BL21(DE3)/pET-phbC/pET-phbAB memberikan 2,25±0,1 g/L biomassa dengan kadar PHB tertinggi 86±0,5% (b/b) setelah inkubasi 72 jam. PHB yang dihasilkan oleh kedua sistem memiliki morfologi berbentuk lembaran dengan kemurnian tinggi dan struktur yang sama seperti yang dihasilkan oleh H. elongata BK-AG25. Analisis kestabilan termal menunjukkan bahwa PHB yang dihasilkan oleh E. coli BL21(DE3)/pET-phbC/pET-phbAB memiliki kestabilan termal yang lebih tinggi dibandingkan dengan PHB yang dihasilkan oleh E. coli BL21(DE3)/pET- phbABC. Data-data ini mengindikasikan bahwa produksi PHB lebih baik dilakukan dalam sistem dua plasmid, yakni menghasilkan PHB dengan kadar dan kestabilan termal iii yang tinggi, meskipun memerlukan waktu inkubasi yang lebih lama. Hal ini kemungkinan disebabkan karena ekspresi gen phbC oleh promotor independen dalam sistem dua plasmid terjadi secara lebih efisien sehingga polimerisasi pembentukan PHB dapat berjalan dengan maksimal. Hasil penelitian ini menyarankan bahwa E. coli BL21(DE3)/pET-phbC/pET-phbAB merupakan klon rekombinan yang potensial untuk digunakan dalam produksi PHB skala industri, namun kestabilan kedua plasmid dalam sel inang masih perlu dipelajari. Kata kunci: H. elongata BK-AG25, Salinivibrio sp., optimasi single factor, sistem dua plasmid, PHB. iv ABSTRACT PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF POLYHYDROXYBUTYRATE (PHB) FROM LOCAL STRAIN OF Halomonas elongata BK-AG25 AND ITS OPTIMIZATION THROUGH RECOMBINANT DNA TECHNOLOGY By Wa Ode Sri Rizki NIM: 30520301 (Doctoral Program in Chemistry) Economic progress and population growth unavoidably increase commodity and lifestyle changes, indirectly impacting plastic consumption and production. Currently, people regularly utilize petroleum-based plastics, which are difficult to decompose naturally, resulting in an accumulation of plastic waste in the environment. Plastic waste pollutes the environment and generates microplastic issues in organisms. New environment-friendly innovations are required to address this issue. Bioplastics are biopolymers that offer more environmentally favorable alternatives to petroleum-based plastics, reduce dependence on petroleum, and foster a circular economy. These materials can be utilized as a substrate for bioplastic production because they quickly break down into elements that support plant and microbial growth. Polyhydroxybutyrate (PHB) is a bioplastic produced by bacteria. PHB has several advantages over other types of bioplastics, especially its ease and speed of biodegradation when interacting with microorganisms in the environment. PHB has been increasingly popular in recent years due to its similar characteristics to petroleum-based plastics such as polypropylene. However, commercial production of PHB currently needs to be improved due to low production efficiency, high production costs, and complex downstream processes. This study aims to enhance the production of PHB from two local bacteria and to increase PHB production by employing recombinant DNA technology in Escherichia coli host cells through one plasmid and two plasmid systems. In this study, Nile red staining suggested that H. elongata BK-AG25 and Salinivibrio sp. can be used to produce PHBs. The structure of the produced PHB was analyzed using FT-IR. In a high medium (HM), both bacteria produced low levels of intracellular PHB, which was then enhanced using a single-factor method. After 72 hours of incubation, H. elongata BK-AG25 with 2.33±0.12 g/L biomass had the highest PHB content of 74±4% (w/w) in HM containing 0.2% (w/v) yeast extract and 5% (w/v) NaCl. Meanwhile, Salinivibrio sp. had 0.17±0.01 g/L biomass that produced the maximum PHB content of 63±6% (w/w) in the HM containing v 15% (v/v) palm oil effluent (POME), 5% (w/v) NaCl, 0.1% (w/v) yeast extract, and 0.1% (w/v) ammonium sulfate. Under these conditions, H. elongata BK-AG25 and Salinivibrio sp. produced PHB 3.5 and 21.6 times more than standard HM, respectively. PHB produced by both bacteria has a sheet-like structure. PHB produced by H. elongata BK-AG25 was evaluated using 1H NMR. However, PHB generated by Salinivibrio sp. could not be assessed due to its low purity caused by using POME as a carbon source. The thermal stability analysis of PHB produced by H. elongata BK-AG25 revealed 91% decomposition at 263 °C, whereas PHB produced by Salinivibrio sp. decomposed only 74% at 285 °C. These findings support the low purity of PHB generated by Salinivibrio sp., despite the most effective purification technique. The presence of Na and Cl atoms in PHB produced by Salinivibrio sp. was revealed by atomic composition analysis using EDS, confirming the low purity of PHB from Salinivibrio sp. As a result, H. elongata BK-AG25 was chosen for further study to improve PHB production using recombinant DNA technology. The phbA, phbB, and phbC genes involved in PHB biosynthesis in H. elongata BK- AG25 were successfully identified using a PCR approach. The sequences of these genes have been identified, and bioinformatics analysis has revealed that palindrome restriction enzyme sequences can be inserted at both ends of each gene to create expression operon systems on one plasmid (pET-phbABC) and two plasmids (pET-phbC/pET-phbAB). The phbA, phbB, and phbC genes in H. elongata BK-AG25 are 1211, 747, and 1813 bp, respectively. SDS-PAGE analysis revealed that the three genes in the one and two plasmid systems expressed identically, resulting in PhbA, PhbB, and PhbC proteins with sizes of 26, 43, and 68 kDa. After 48 hours of incubation in LB medium with 2% (w/v) glucose, recombinant E.