PENGEMBANGAN PRODUKSI HETEROLOG SKUALENA DARI BAKTERI Virgibacillus salarius 19.PP.Sc1.6 PADA BAKTERI Escherichia coli BL21(DE3) TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh IRISHTSANY INDIRA LAILY NURDIN NIM: 21123014 (Program Studi Magister Bioteknologi) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Mei 2024 1 PENGEMBANGAN PRODUKSI HETEROLOG SKUALENA DARI BAKTERI Virgibacillus salarius 19.PP.Sc1.6 PADA BAKTERI Escherichia coli BL21(DE3) Oleh Irishtsany Indira Laily Nurdin NIM: 21123014 (Program Studi Magister Bioteknologi) Indonesia merupakan negara dengan keanekaragaman mikroorganisme yang memiliki berbagai potensi dalam bidang industri. Salah satu contohnya yakni bakteri Virgibacillus salarius 19.PP.Sc1.6 yang ditemukan di Laut Jawa Selatan. Bakteri ini diketahui memiliki gen sqs yang mampu menghasilkan skualena, molekul yang banyak dimanfaatkan pada industri kosmetik. Nilai impor skualena Indonesia yang selalu meningkat setiap tahunnya mengindikasikan bahwa kebutuhan skualena yang tinggi belum dapat terpenuhi oleh produksi dalam negeri, sehingga diperlukan alternatif sumber skualena yang dapat diproduksi secara efisien dan berkelanjutan. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan produksi skualena secara heterolog pada bakteri E. coli BL21(DE3) dengan melakukan isolasi gen sqs dari V. salarius 19.PP.Sc1.6, konstruksi gen sqs pada vektor ekspresi dengan menggunakan variasi urutan ribosome binding site (RBS), serta mengoptimasi produksi skualena dengan variasi konsentrasi isopropyl β- d-1- thiogalactopyranoside (IPTG). Gen sqs dari V. salarius 19.PP.Sc1.6 berhasil diisolasi dengan panjang basa nukleotida 822 pb serta memiliki urutan yang identik dengan gen sqs dari hasil whole genome sequencing V. salarius 19.PP.Sc1.6, memperlihatkan tidak adanya mutasi. Selanjutnya, dilakukan konstruksi vektor ekspresi BSqs dengan menggabungkan isolat gen sqs dan backbone plasmid B04- T7-AmpHigh menggunakan metode BASIC assembly melalui penggunaan RBS linker dan neutral linker. Metode BASIC assembly memungkinkan konstruksi plasmid secara modular dengan menggunakan biopart dan DNA linker yang dapat dikombinasikan dengan mudah. Pada penelitian ini diujikan kemampuan 3 RBS dengan sekuens berbeda yang kemudian menghasilkan 3 variasi plasmid; BSqs1, BSqs2, dan BSqs3. Setelah dirakit dan divalidasi dengan PCR, plasmid BSqs ditransformasi ke dalam bakteri E. coli BL21(DE3) yang sudah mengandung plasmid JBEI-3085. Plasmid JBEI-3085 berisikan gen-gen prekursor dalam jalur biosintesis skualena, sehingga penambahannya diharapkan dapat meningkatkan jumlah molekul prekursor untuk menghasilkan skualena. E. coli BL21(DE3) 2 rekombinan tersebut lalu digunakan untuk produksi heterolog skualena yang dikuantifikasi kadarnya dengan menggunakan HPLC. Tahap pengujian efek variasi sekuens RBS menunjukkan bahwa perlakuan ini memiliki pengaruh signifikan (p < 0,05) terhadap produksi skualena. U3R3 menghasilkan skualena sebanyak 191,43 mg/L, sekitar 12,5% lebih banyak dibanding U2R2 dan 16,6% lebih banyak dibanding U1R1. Pengujian pengaruh variasi konsentrasi IPTG kemudian dilakukan pada kultur yang mengandung U3R3. Empat variasi konsentrasi IPTG yaitu 0; 0,05; 0,1, dan 0,2 mM, digunakan untuk mencari konsentrasi terbaik dalam memaksimalkan produksi skualena. Penambahan IPTG akan meregulasi produksi skualena dengan menginduksi ekspresi T7 RNA polimerase yang bertugas mentranskripsikan gen sqs di dalam plasmid BSqs yang dikontrol oleh promoter T7. Produksi skualena tertinggi dihasilkan oleh penggunaan IPTG 0,05 mM (142,08 mg/L), namun tidak terdapat perbedaan signifikan pada hasil produksi skualena pada setiap konsentrasi IPTG (p > 0,05). Penelitian ini berhasil mengembangkan produksi skualena secara heterolog pada bakteri E. coli BL21(DE3) dengan memanfaatkan gen sqs dari bakteri Laut Jawa Selatan Indonesia, V salarius 19.PP.Sc1.6. Penggunaan U3R3 dan IPTG sebesar 0,05 mM merupakan kombinasi perlakuan terbaik dalam menghasilkan skualena pada penelitian ini. Kata kunci: skualena, BASIC assembly, skualena synthase, overekspresi, IPTG, RBS 3 1 ABSTRACT DEVELOPMENT OF HETEROLOGOUS SQUALENE PRODUCTION FROM Virgibacillus salarius 19.PP.Sc1.6 IN Escherichia coli BL21(DE3) By Irishtsany Indira Laily Nurdin NIM: 21123014 (Program Studi Magister Bioteknologi) Indonesia is a country with a diversity of microorganisms that have various potentials in the industrial sector. One example is the bacteria Virgibacillus salarius 19.PP.Sc1.6 found in the South Java Sea. This bacteria is known to have the sqs gene that can produce squalene, a molecule that is widely used in the cosmetics industry. The value of Indonesia's squalene imports which always increases every year indicates that the high demand for squalene cannot be met by domestic production, so alternative sources of squalene are needed that can be produced efficiently and sustainably. This study aims to develop heterologous squalene production in E. coli BL21(DE3) bacteria by isolating the sqs gene from V. salarius 19.PP.Sc1.6, constructing the sqs gene in an expression vector using variations in the ribosome binding site (RBS) sequence, and optimizing squalene production with variations in the concentration of isopropyl β- d-1- thiogalactopyranoside (IPTG). The sqs gene from V. salarius 19.PP.Sc1.6 was successfully isolated with a nucleotide base length of 822 bp and had an identical sequence to the sqs gene from the whole genome sequencing results of V. salarius 19.PP.Sc1.6, showing no mutations. Furthermore, the construction of the BSqs expression vector was carried out by combining the sqs gene isolate and the B04- T7-AmpHigh plasmid backbone using the BASIC assembly method through the use of RBS linker and neutral linker. The BASIC assembly method allows the construction of plasmids in a modular manner using bioparts and DNA linkers that can be easily combined. In this study, the ability of 3 RBS with different sequences was tested which then produced 3 plasmid variations; BSqs1, BSqs2, and BSqs3.