PENGOLAHAN PASCAPANEN BIJI KAKAO (Theobroma cacao L.) DENGAN MENGGUNAKAN SOLID-STATE FERMENTOR DAN PENDEKATAN METABOLOMIK UNTUK PENENTUAN KUALITAS BIJI KAKAO TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh DITTA PUTRI KUMALASARI NIM: 21120025 (Program Studi Magister Bioteknologi) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Oktober 2022 i ABSTRAK PENGOLAHAN PASCAPANEN BIJI KAKAO (Theobroma cacao L.) DENGAN MENGGUNAKAN SOLID-STATE FERMENTOR DAN PENDEKATAN METABOLOMIK UNTUK PENENTUAN KUALITAS BIJI KAKAO Oleh Ditta Putri Kumalasari NIM: 21120025 (Program Studi Magister Bioteknologi) Di Indonesia, kakao menjadi salah satu komoditas andalan perkebunan yang cukup penting bagi perekonomian nasional. Namun, mutu biji kakao Indonesia masih berada pada grade 3. Hal ini dikarenakan sebagian besar produksi biji kakao berasal dari area perkebunan rakyat sebesar 98,38%, sedangkan milik pemerintah dan swasta hanya sebesar 0,75% dan 0,87%. Hampir 80% kakao hasil perkebunan rakyat belum diolah dengan baik. Salah satu sumber perkebunan kakao rakyat berada di kawasan Kampung Coklat Senara, Desa Genggelang, Kecamatan Gangga, Kabupaten Lombok Utara, Nusa Tenggara Barat (NTB). Di daerah tersebut, pengolahan biji kakao masih sederhana dengan melakukan fermentasi alami atau bahkan beberapa petani memilih untuk menjual langsung (tanpa fermentasi). Hal ini menyebabkan cita rasa dan aroma biji kakao menjadi tidak konsisten. Sehingga perlu dilakukan fermentasi terkontrol untuk menstandardisasi proses fermentasi. Tujuan dari penelitian ini ialah (1) mengetahui dinamika populasi mikroorganisme yang terjadi selama proses fermentasi alami menggunakan kotak kayu skala 20 kg selama 5 hari; (2) mengetahui spesies mikroorganisme yang digunakan sebagai inokulum pada fermentasi terkontrol; (3) melakukan optimasi fermentasi terkontrol dengan variasi jenis inokulum tunggal (bakteri asam laktat), dan konsorsium (bakteri asam laktat:ragi) (1:1) dengan konsentrasi inokulum 10% (v/w) dan kepadatan sel 10 9 CFU/mL pada suhu 37°C selama 5 hari menggunakan besek bambu skala 2 kg; (4) melakukan scale up fermentasi terkontrol dengan penambahan variasi inokulum dan lama waktu fermentasi terbaik pada skala 20 kg menggunakan fermentor kayu yang dilengkapi dengan IoT (Internet of Things) pada suhu 37°C; serta (5) mengetahui metabolit prekursor yang mempengaruhi cita rasa kakao pada kondisi optimum. Karakteristik proses fermentasi kakao ditentukan dengan parameter suhu, pH, susut bobot, indeks fermentasi, kadar air, dan jumlah biji kakao per 100 gram, serta uji organoleptik. Hasil isolasi mikroorganisme yang didapat selama proses fermentasi alami juga dilakukan penapisan dengan uji enzimatis (pektinolitik, proteolitik, amilolitik, selulolitik, lipolitik), uji fermentasi gula (glukosa, fruktosa, sukrosa), ii dan total produksi alkohol. Selanjutnya isolat terpilih dari hasil uji enzimatis tersebut ditambahkan pada proses fermentasi terkontrol menggunakan besek bambu skala 2 kg pada suhu 37°C, dan dilakukan pengambilan data setiap 24 jam selama 5 hari. Perlakuan penambahan inokulum terbaik hasil optimasi kemudian digunakan pada proses scale up menggunakan fermentor kayu berbasis IoT dengan skala 20 kg pada suhu 37 ° C. Biji kakao terfermentasi pada kondisi optimum tersebut, kemudian dianalisis metabolit menggunakan GC-MS. Analisis statistika untuk mengetahui korelasi kandungan metabolit selama proses fermentasi menggunakan multivariat Principal Component Analysis (PCA) pada software Minitab ® . Dari hasil penelitian ini diketahui pada proses fermentasi alami, dinamika populasi mikroorganisme kakao didominasi oleh tiga kelompok mikroorganisme (ragi, bakteri asam laktat, dan bakteri asam asetat) dengan adanya perubahan suhu dimulai dari 28°C sampai 43°C. Pada hari ke-0, populasi mikroorganisme didominasi oleh ragi dengan kepadatan sel sebesar log 7,88 CFU/gram, namun mengalami penurunan sebesar log 0,46 CFU/gram hingga hari ke-2, dan mengalami kenaikan kembali sebesar log 1,53 CFU/gram sampai hari ke-5. Kemudian, populasi mikroorganisme dilanjutkan oleh bakteri asam laktat yang cenderung mengalami peningkatan dari hari ke-0 sampai hari ke-5 dengan kenaikan log jumlah sel sebesar 1,20 CFU/gram. Sedangkan bakteri asam asetat menunjukkan jumlah populasi terendah selama proses fermentasi, nilai log jumlah sel pada hari ke-0 sebesar 6,72 CFU/gram, dan hari ke-5 sebesar 8,57 CFU/gram. Perubahan dinamika mikroorganisme ini diikuti oleh perubahan derajat keasaman (pH) dengan nilai pH terendah sebesar 3,30 pada hari ke-3 dan pH tertinggi 6,45 pada hari ke-5. Karakteristik fermentasi alami mempunyai nilai indeks fermentasi 50%, kadar air 4,90%, serta kualitas biji per 100 gram masuk dalam kategori B. Dari hasil fermentasi alami juga berhasil diisolasi 14 isolat ragi, 15 isolat bakteri asam laktat, dan 8 isolat bakteri asam asetat. Berdasarkan hasil uji enzimatis berhasil terseleksi 2 isolat unggul, yaitu isolat H5B7-1 (bakteri asam laktat) dan H1Y4-1 (ragi). Isolat H5B7-1 (Lactiplantibacillus plantarum) mempunyai kemampuan amilolitik yang tinggi, sedangkan isolat H1Y4-1 (Candida tropicalis) mempunyai kemampuan produksi alkohol paling tinggi serta menunjukkan nilai positif (+) pada uji fermentasi. Kedua isolat tersebut ditambahkan pada proses fermentasi terkontrol dengan variasi inokulum tunggal bakteri asam laktat (H5B7-1) dan inokulum konsorsium (bakteri asam laktat-H5B71:ragi-H1Y4-1) (1:1) dengan konsentrasi 10% (v/w), dan kepadatan sel H5B7-1 sebesar 3,4 x 10 9 CFU/mL serta H1Y4-1 sebesar 1,1 x 10 9 CFU/mL. Hasil fermentasi terkontrol menunjukkan bahwa penambahan inokulum tunggal bakteri asam laktat (H5B7-1) pada hari ke-4 lebih baik dengan parameter indeks fermentasi menunjukkan nilai tertinggi mencapai 75% dibandingkan dengan penambahan inokulum konsorsium sebesar 70%. Hasil scale-up juga mampu meningkatkan kualitas biji kakao dengan nilai indeks fermentasi mencapai 90% biji kakao well fermented, dan masuk dalam kategori A (88 biji) untuk jumlah biji per 100 gram. Adapun kandungan metabolit biji kakao pada fermentasi terkontrol terbaik (hari ke-4) berkorelasi positif dengan metabolit prekursor aroma berupa asam amino leusin (sweet chocolate), threonin (chocolate), fenilalanin (almond, floral/honey), dan 2,3-butanediol (buttery). Selain itu, terdapat pula metabolit prekursor cita rasa pahit (bitterness-cocoa flavor) dengan tingginya iii kandungan asam amino glutamat. Hal ini berkorelasi juga dengan hasil uji organoleptik yang menunjukkan aroma coklat cukup kuat, dengan rasa pahit dan warna cokelat agak gelap. Kata kunci: fermentasi, kakao, isolasi, bakteri asam laktat, ragi, bakteri asam asetat, scale-up, metabolit iv ABSTRACT POST-HARVEST PROCESSING OF COCOA BEANS (Theobroma cacao L.) USING SOLID STATE FERMENTOR AND METABOLOMIC APPROACH TO DETERMINE THE QUALITY OF COCOA BEANS By Ditta Putri Kumalasari NIM: 21120025 (Master’s Program in Biotechnology) In Indonesia, cocoa is one of the mainstay commodities of plantations and quite important for the national economy. However, the quality of Indonesian cocoa beans is still at grade 3. This is because most of the cocoa bean production comes from smallholder plantation (98.38%), while those owned by the government and private sector are only 0.75% and 0.87%, respectively. Nearly 80% of the cocoa produced by smallholders has not been processed properly. One source of cocoa plantations is in the Senara Chocolate Village area, Genggelang Village, Gangga District, North Lombok Regency, West Nusa Tenggara (NTB). In these areas cocoa beans processing is still simple by doing natural fermentation or the beans are sold directly (without fermentation). This causes the taste and aroma of cocoa beans to be inconsistent. Therefore, it is necessary to do controlled fermentation to standardize the fermentation process. The aims of this study were (1) to determine the dynamics of the microbial population that occurred during the natural fermentation process using a 20 kg wooden box for 5 days; (2) knowing the microbial species used as inoculum in controlled fermentation; (3) optimizing controlled fermentation with a single inoculum variation (lactic acid bacteria), and a consortium (lactic acid bacteria: yeast) (1:1) with an inoculum concentration of 10% (v/w) and a cell density of 109 CFU/mL at a temperature of 37°C for 5 days using a 2 kg scale bamboo basket; (4) scale up controlled fermentation with the addition of variations in inoculum and the best fermentation time on a scale of 20 kg using a wood fermenter equipped with IoT (Internet of Things) at 37°C; and (5) examine the precursor metabolites that affect the taste of cocoa at optimum conditions. The characteristics of the cocoa fermentation process were determined by parameters of temperature, pH, weight loss, fermentation index, moisture content, and number of cocoa beans per 100 grams, as well as organoleptic tests. The results of microbial isolation obtained during the natural fermentation process were also screened using enzymatic tests (pectinolytic, proteolytic, amylolytic, cellulolytic, lipolytic), sugar fermentation tests (glucose, fructose, sucrose), and total alcohol production. Furthermore, the selected isolates from the results of the enzymatic test were added to a controlled fermentation process using a 2 kg scale bamboo v container at 37 °C, and data were collected every 24 hours for 5 days. Next, scale up with the best inoculum treatment using an IoT-based wood fermentor with a scale of 20 kg at 37 °C. Cocoa beans were fermented at the optimum conditions, then analyzed for metabolites using GC-MS. Statistical analysis to determine the correlation of metabolite content during the fermentation process used multivariate Principal Component Analysis (PCA) on Minitab® software. Results from this study showed that during natural cocoa fermentation process, the microbial population dynamics was dominated by three groups of microbes (yeast, lactic acid bacteria, and acetic acid bacteria) with temperature changes starting from 28 °C to 43 °C. On day 0, the microbial population was dominated by yeast with a cell density of log 7.88 CFU/gram, but decreased by log 0.46 CFU/gram in day 2, and increased again by log 1.53 CFU /gram on the 5 th day. Then, the microbial population was continued by lactic acid bacteria, which tended to increase from day 0 to day 5 with an increase in the log cell number of 1.20 CFU/gram. While acetic acid bacteria showed the lowest population during the fermentation process, the log value of the number of cells on day 0 was 6.72 CFU/gram, and day 5 was 8.57 CFU/gram. This change in microbial dynamics was followed by a change in the degree of acidity (pH) with the lowest pH value of 3.30 on the 3rd day and the highest pH of 6.45 on the 5th day. The characteristics of natural fermentation have a fermentation index value of 50%, water content of 4.90%, and quality of beans per 100 grams included in category B. From the results of natural fermentation, 14 isolates of yeast, 15 isolates of lactic acid bacteria, and 8 isolates of acetic acid bacteria were also isolated. Based on the results of the enzymatic test, 2 superior isolates were selected, namely H5B7-1 (lactic acid bacteria) and H1Y4-1 (yeast). The H5B7-1 isolate (Lactiplantibacillus plantarum) had a high amylolytic ability, while the H1Y4-1 isolate (Candida tropicalis) had the highest alcohol production ability and showed a positive (+) value in the fermentation test. The two isolates were added to a controlled fermentation process with a single inoculum variation of lactic acid bacteria (H5B7-1) and a consortium inoculum (lactic acid bacteria-H5B7-1 : yeast-H1Y4-1) (1:1) with a initial microbial concentration of 10% (v/w), and the cell density of H5B7-1 was 3.4 x 10 9 CFU/mL and H1Y4-1 was 1.1 x 10 9 CFU/mL. The results of controlled fermentation showed that the addition of a single inoculum of lactic acid bacteria (H5B7-1) on day 4 was better with the fermentation index parameter showing the highest value reaching 75% compared to the addition of a consortium inoculum of 70%. The results of the scale-up are also able to improve the quality of cocoa beans with a fermentation index value reaching 90% of well fermented cocoa beans, and are included in category A (88 beans) for the number of beans per 100 grams. The metabolite content of cocoa beans in the best controlled fermentation (day 4) was positively correlated with the aroma precursor metabolites in the form of amino acid leucine (sweet chocolate), threonine (chocolate), phenylalanine (almond, floral/honey), and 2,3-butanediol (buttery). In addition, there are also precursor metabolites of bitter taste (bitterness-cocoa flavor) with a high content of glutamic acid. This is also correlated with the results of organoleptic tests, which show the aroma of chocolate is quite strong, with a bitter taste and a slightly dark brown color. vi Keywords: fermentation, cocoa, isolation, lactic acid bacteria, yeast, acetic acid bacteria, scale¬-up, metabolites vii PENGOLAHAN PASCAPANEN BIJI KAKAO (Theobroma cacao L.) DENGAN MENGGUNAKAN SOLID-STATE FERMENTOR DAN PENDEKATAN METABOLOMIK UNTUK PENENTUAN KUALITAS BIJI KAKAO Oleh Ditta Putri Kumalasari NIM: 21120025 (Program Studi Magister Bioteknologi) Institut Teknologi Bandung Menyetujui Tim Pembimbing Tanggal 19 Oktober 2022 Pembimbing I Dr. Eng. Kamarisima, S.Si., M.Si Prof. Dr. Pingkan Aditiawati, MS NIP. 19900301201404001 NIP. 195809101986012001 Pembmmmmmmmmmimmmmmmmmbi Pembimbing II viii PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis Magister yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada penulis dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin penulis dan harus disertai dengan kaidah ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Sitasi hasil penelitian Tesis ini dapat di tulis dalam bahasa Indonesia sebagai berikut: Kumalasari, Ditta Putri. (2022): Pengolahan pascapanen biji kakao (Theobroma cacao L.) dengan menggunakan solid-state fermentor dan pendekatan metabolomik untuk penentuan kualitas biji kakao, Tesis Program Magister, Institut Teknologi Bandung. dan dalam bahasa Inggris sebagai berikut: Kumalasari, Ditta Putri. (2022): Post-harvest processing of cocoa beans (Theobroma cacao L.) using solid state fermentor and metabolomic approach to determine the quality of cocoa beans, Master’s Thesis, Institut Teknologi Bandung. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Dekan Sekolah Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. ix Dipersembahkan kepada orang tua, adik, keluarga besar, serta sahabat- sahabatku tercinta yang senantiasa mendukung lahir dan batin. x KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Pengolahan Pascapanen Biji Kakao (Theobroma cacao L.) dengan Menggunakan Solid State Fermentor dan Pendekatan Metabolomik untuk Penentuan Kualitas Biji Kakao sebagai salah satu syarat kelulusan Program Studi Magister Bioteknologi, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati (SITH), Institut Teknologi Bandung. Penelitian dan penulisan tesis ini tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Dengan demikian pada kesempatan ini, penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak tersebut sebagai berikut: 1. Dr. Eng. Kamarisima, S.Si., M.Si., selaku Dosen Pembimbing I sekaligus Dosen Wali, atas kesabarannya dalam memberikan bimbingan, dampingan, dukungan, kritik, dan saran selama pengerjaan penelitian ini. 2. Prof. Dr. Pingkan Aditiawati, MS., selaku Dosen Pembimbing II yang senantiasa memberikan bimbingan, nasihat, dampingan, kritik, dan saran selama pengerjaan penelitian ini. 3. Seluruh dosen program studi Magister Bioteknologi yang telah memberikan ilmu dan bimbingan selama menempuh studi di Bioteknologi. 4. Beasiswa LPDP yang telah membiayai pendidikan dan memberikan kesempatan kepada penulis untuk bisa melanjutkan studi program Magister Bioteknologi ITB 5. Bapak, Ibu, Adik Dimas, serta keluarga besar yang selalu mendukung moril maupun materil kepada penulis. 6. Pak Pardan sekeluarga serta warga Kampung Coklat Dusun Senara, Desa Genggelang, Kab. Lombok Utara-NTB yang senantiasa menerima dan membantu selama melakukan penelitian di lapangan. 7. Dr. Sarkono, Bunda Dewi, Zahwa, Didik, Wanda, dan teman-teman Biologi Universitas Mataram yang senantiasa membantu dan memudahkan selama melakukan penelitian di Laboratorium Biologi Lanjut Unram. xi 8. Tim Kakao (Diemas, Yusuf, Yuda, Kak Sonia, Chaca, Affdila) atas kerja samanya selama mengerjakan penelitian ini. 9. Mas Daus yang senantiasa bersedia mendengarkan keluh-kesah dan selalu membantu dalam penulisan. 10.