1 I. PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang Bioetanol merupakan bahan bakar nabati cair yang paling banyak digunakan (Demirbas, 2005) dan penggunaannya dapat mengurangi ketergantungan terhadap bahan bakar fosil, mengurangi polusi udara dan perubahan iklim global akibat penumpukan karbon dioksida (Wu dkk., 2007; Murdiyatmo, 2006; Demirbas, 2005). Produksi bioetanol di Indonesia ditujukan untuk mencapai elastisitas energi pada tahun 2025 (Perpres No.5 Tahun 2006) dengan target produksi sebesar 5,7 juta liter dan diharapkan dapat mengurangi subsidi pemerintah terhadap bahan bakar bensin yang diproyeksikan mencapai Rp. 142,292 triliun pada tahun 2011 (Dillon dkk., 2008; Pusat Data dan Informasi ESDM, 2012).Ketersediaan bahan baku yang murah dan tidak tergolong sebagai bahan pangan manusia merupakan salah satu kendala dalam industri etanol di Indonesia (Murdiyatmo, 2006), yang saat ini menggunakan ubi kayu, molases dan gula (Tjakrawan, 2008; Legowo, 2008 dalam Dillon dkk., 2008). Untuk mengatasi permasalahan tersebut dapat dilakukan pemanfaatan limbah cair yang mengandung senyawa organik konsentrasi tinggi hasil aktivitas agro industri seperti limbah cair industri minyak sawit, karet, kakao, gula dan kopi yang memiliki nilai chemical oxygen demand (COD) di atas 4.000 mg/L melalui proses anaerob (Grady dkk., 1999). Potensi limbah cair tersebut sebagai substrat pembentukan etanol sangat besar mengingat Indonesia merupakan produsen minyak mentah sawit, karet alam dan kakao berturut-turut nomor satu, dua dan tiga di dunia (GAPKI, 2011; Vijayaraghavan, 2008a dalam Mohammadi dkk., 2010; Anonim, 2000 dalam Ardhana dan Fleet, 2003). Saat ini, potensi limbah tersebut belum termanfaatkan secara optimal, sebagai contoh adalah pengolahan limbah cair industri minyak sawit yang menggunakan sistem kolam terbuka anaerob/fakultatif yang melepaskan gas metan ke lingkungan sebesar 33 kg/ton minyak sawit yang dihasilkan (Schuchardt dkk., 2008). Produksi bioetanol oleh mikroorganisme anaerob dibedakan berdasarkan jalur (pathway) konversi asam piruvat menjadi asetaldehid yang selanjutnya direduksi 2 menjadi alkohol oleh alkohol dehidrogenase (Bringer-Meyer dkk.,1986 dalam Rogers dkk., 2006;Kim dkk., 2008; Gottschalk, 1986). Jalur pertama yaitu konversi asam piruvat menjadi asetil-CoA dan CO 2 dan selanjutnya direduksi menjadi asetaldehid. Jalur ini digunakan oleh bakteri kultur campuran anaerob yang dapat memanfaatkan limbah cair organik konsentrasi tinggi sebagai substrat (Syafila dkk., 2010;Ren dkk., 2007; Ren dkk., 2006; Wang dkk., 2006a; Ren dkk., 1997). Jalur ke dua yaitu konversi langsung asam piruvat menjadi asetaldehid dengan bantuan enzim piruvat dekarboksilase digunakan olehZymomonas mobilis, Sarcina ventriculi, Erwinia amylovora, bakteri asam asetat dan Saccharomyces cerevisiae (Kim dan Gad, 2006; Kosaric dan Sukan, 2001; Gottschalk, 1986). Umumnya produksi bioetanol dihasilkan melalui tipe jalur ke dua menggunakan kultur murni untuk substrat yang mudah terdegradasi seperti molase, sweet whey, glukosa (Lin dkk., 2011; Lin dkk., 2010; Chotineeranat dkk., 2010; Zhao dkk., 2009; Leite dkk., 2000; Azenha dkk., 2000) dan dari substrat berpati atau berlignoselulosa dengan bantuan proses pengolahan pendahuluan seperti sakarifikasi, hidrolisis asam, termal (pemanasan), hidrolisis enzimatik dan proses pemecahan polimer karbohidrat secara kimia atau fisika (Narasimhulu dkk., 2010; Alam dkk., 2009; Yamashita dkk., 2008; Kilonzo dkk., 2007; Demirbas, 2005; Lewis dkk., 2005). Proses ini membutuhkanperhatian khusus untuk mencegah terjadi kontaminasi sehingga membutuhkan biaya besar untuk proses sterilisasi dan investasi alat jika diaplikasikan dalam skala industri (Rodriguez dkk., 2007). Sementara itu, proses pembentukan etanol oleh bakteri kultur campuran anaerob terjadi pada fasa asidogenesa disertai dengan berbagai produk samping yang dihasilkan seperti asam asetat, butirat, propionat dan laktat (Ren dkk., 2007; Ren dkk., 2006; Wang dkk., 2006; Ren dkk., 1997). Komposisi produk-produk tersebut dipengaruhi oleh jalur metabolisme dari populasi bakteri yang terlibat dalam fermentasi yang dipengaruhi oleh beberapa faktor di antaranya pH, tekanan parsial hidrogen dan trace element (Syafila dkk., 2010; Ren dkk., 1997; Yenigun dkk., 1996). Etanol dapat terbentuk dalam rentang pH 4-5 (Wang dkk., 2006; Ren dkk., 2006; Yu dan Fang, 2003; Ren dkk., 1997); pH 5-6 (Fang dan Liu, 2002) dan pH 8 3 (Temudo dkk., 2008).Gas H 2 dan CO2 akan dihasilkan selama proses asidogenesa berlangsung (Ren dkk., 2007; Ren dkk., 2006; Wang dkk., 2006; Ren dkk., 1997). Tekanan parsial hidrogen (pH 2) akan mempengaruhi pembentukan produk fasa asidogenesa (Harper dan Pohlan, 1986 dalam Anderson dkk., 2006) dan pada fermentasi etanol sebaiknya direduksi untuk menghindari penurunan laju metabolisme (Ren dkk., 1997). Upaya pengendalian jalur metabolisme bakteri campuran anaerob dengan flushing gas N 2 telah dilakukan oleh beberapa peneliti. Fynn dan Syafila (1990); Syafila dkk. (1998) menyatakan flushing gas N 2 dapat mengoptimalkan pembentukan asam asetat dan menghambat pembentukan laktat, propionat dan butirat dari glukosa limbah cair industri minyak sawit. Sedangkan pengaruhnya terhadap pembentukan etanol belum dibahas. Sementara itu, flushing gas N 2 dan CO2 masing-masing sebesar 0,02; 0,04; 0,05; 0,06 dan 0,08 L/menit/L cairandapat meningkatkan produksi hidrogen namun tidak mempengaruhi etanol yang dihasilkan dari glukosa (Kim dkk. 2006; Mizuno dkk.2000). Flushing N 2 sebesar 0,03; 0,11 dan 0,17 L/menit/Lcairanpada asidogenesa limbah cair kakao belum optimal meningkatkan pembentukan etanol dan belum menggambarkan pengaruh flushing terhadap perubahan komposisi asam lemak volatil dan non volati (Syafila dkk., 2010). Sementara itu, pengaruh flushing gas N 2 terhadap pembentukan etanol dari limbah limbah cair organik artifisial yang mengandung pati, minyak dan lemak belum pernah dilaporkan. Upaya lain untuk meningkatkan produksi etanol adalah dengan penambahan elemen mikro. Ion elemenmikrosangat dibutuhkan karena salah satu fungsinya sebagai ko-faktor enzim untuk suatu reaksi enzimatis spesifik. Pada tahap asidogenesa, penambahan mikro elemen dalam konsentrasi tertentu dapat menyebabkan pergeseran (meningkatkan dan atau menurunkan) pembentukan suatu produk, mempengaruhi laju degradasi senyawa organik seperti karbohidrat dan protein serta dapat bersifat toksik bagi biomassa (Yu dkk., 2001; Yenigün dkk., 1996). Meskipun manfaatnya penambahan mikro elemen telah diketahui, namun informasi kebutuhan nutrisi oleh bakteri hidrolisis, bakteri fermentasi asam atau bakteri asetogen masih terbatas (Zhang dkk., 2003). Sebagai enzim kunci pembentukan etanol, alkohol dehidrogenase (ADH) yang terdapat dalam bakteri gram negatif dan organisme penghasil etanol dapat berupa ADH-I yang 4 mengandung ion Zn dan ADH-II yang mengandung ion Fe (Moon dkk., 2011; Rogers dkk., 2006; Presecki dan Racki, 2004). Kedua jenis ADH tersebut menggunakan NADH untuk mereduksi asetaldehid menjadi etanol.Penambahan ion Zn 2+ dan Fe 2+ pada kultur murni dalam jumlah tertentu dapat meningkatkan produksi etanol (Saxenan dan Tanner, 2010; Zhao dkk., 2009; Wang dkk., 2007; Avci dan Domnez, 2006; Leite dkk., 2000; Azenha dkk., 2000; Park dkk., 1992). Penambahan ion Fe pada kultur campuran anaerob telah dilakukan oleh Wang dan Wan (2008), Mentari (2008). Berdasarkan penjelasan di atas, maka penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh pengendalian pH, flushing gas N 2 dan penambahan ion Fe 2+ dan Zn 2+ terhadap pembentukan etanol dan pergeseran pembentukan produk asidogenesa dari limbah cair artifisialyang mengandung pati, minyak dan pepton. Kondisi optimum pembentukan etanol yang diperoleh akan diujicobakan pada limbah cair industri minyak sawit. I.2 Perumusan Masalah Penelitian Pembentukan etanol dan pergeseran pembentukan produk asidogenesa sangat dipengaruhi oleh bakteri yang digunakan dan kondisi lingkungan. Derajat keasaman berpengaruh terhadap aktivitas ADH dan etanol dapat terbentuk secara optimal pada rentang pH yang berbeda-beda, baik asam maupun basa sehingga pH optimal untuk pembentukan etanol oleh bakteri kultur campuran anaerob yang digunakan dalam penelitian ini harus diteliti.Selain pengaruh pH, keberadaan Zn 2+ dan Fe 2+ juga mempengaruhi aktivitas ADH. Penambahan ion-ion logam tersebut pada konsentrasi tertentu dapat meningkatkan produksi etanol oleh Clostridium ragsdalei, C. thermohydrosulfuricum, HPB B49, Thermophilic anaerobic, T. ethanolicus (JW200), T. thermohydrosulfuricus, S. pombe dan S. cerevisiae.Namun demikian, besaran konsentrasi dan pengaruhnya terhadap produksi etanol oleh bakteri kultur campuran anaerob belum banyak diketahui, sehingga harus diteliti lebih lanjut. Faktor lain yang juga berpengaruh terhadap pemilihan jalur metabolisme substrat adalah pH 2yang akan mengarahkan ke pembentukan suatu produk. Pengendalian pH 2 dengan flushinggas N 2 dapat mempengaruhi pembentukan produk akhir asidogenesa. 5 Berdasarkan uraian di atas, kondisi lingkungan seperti derajat keasaman; pengaruh ion Zn 2+ dan Fe 2+ dan flushing gas N 2 dapat mempengaruhi pembentukan etanol dan pergeseran produk asidogenesa, sehingga perlu diteliti lebih lanjut. I.3 Maksud dan Tujuan Penelitian Maksud dari penelitian ini adalah mengembangkan potensi limbah cair organik konsentrasi tinggi sebagai substrat pembentukan etanol yang murah dan ketersediaannya sangat banyak di Indonesia. Adapun tujuan umum dari penelitian ini adalah mempelajari mekanisme pembentukan etanol dan pergeseran pembentukan produk asidogenesa dari limbah artifisial dan limbah indutsri minyak sawit melalui pengendalian operasional circulating bed reactor. Adapun tujuan khusus penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Mempelajari pengaruh pengendalian pH dan sterilisasi substrat terhadap pembentukan etanol dan pergeseran pembentukan produk asidogenesa dari proses biodegradasi limbah cair organik artifisial oleh bakteri kultur campuran anaerob, 2. Membandingkan produksi etanol oleh bakteri kultur campuran anaerob dengan ragi Saccharomyces cerevisiaedari proses biodegradasi limbah cair organik artifisial, 3. Mempelajari pengaruh flushing gas N 2 terhadap jalur pembentukan etanol dan pergeseran pembentukan produk asidogenesadari proses biodegradasi limbah cair organik artifisial oleh bakteri kultur campuran anaerob, 4. Mempelajari pengaruh penambahan ion logam Fe 2+ dan Zn 2+ dan flushing gas N 2terhadap pembentukan etanol dan pergeseran pembentukan produk asidogenesadari proses biodegradasi limbah cair organik artifisial oleh bakteri kultur campuran anaerob, 5. Mempelajari flushing gas N 2 terhadap jalur pembentukan etanol dan distribusi produk asidogenesa dari biodegradasi limbah cair industri minyak sawit, 6. Mempelajari pengaruh penambahan ion logam Fe 2+ dan campuran Fe 2+ /Zn 2+ terhadap pembentukan etanol dan pergeseran pembentukan produk 6 asidogenesadari proses biodegradasi limbah cair industri minyak sawit oleh bakteri kultur campuran anaerob, 7. Isolasi dan identifikasi konsorsium bakteri pada kondisi operasional optimum pembentukan etanol dari limbah cair artifisial. I.4 Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup penelitian yang akan dilakukan adalah sebagai berikut: 1. Limbah cair yang digunakan adalah limbah cair organik artifisial yang mengandung pati, pepton dan minyakyang digunakan pada tahap pengendalian pH dan flushing gas N 2 dan penambahan ion Fe 2+ dan Zn 2+ . Untuk aplikasi kondisi operasional optimum penelitian digunakan limbah asli industri minyak sawit, 2. Bibit biomassa bakteri anaerob berasal dari instalasi pengolahan limbah sawit dan rumen, sedangkanSaccharomyces cerevisiae dari Pusat Antar Universitas ITB, 3. Variasi flushinggas N 2 sebesar 0,15 dan 0,2 L/menit/Lcairan; penambahan Fe 2+ sebesar 40; 50; 100; 200 dan 400 mg/L; penambahan Zn 2+ sebesar 0,5; 1; 1,5; 2,5 dan 5 mg/L pada limbah cair organik artifisial. Pengujian pada limbah cair industri minyak sawit dilakukan dengan flushing N 2sebesar 0,2 L/menit/L cairandengan penambahan ion Fe 2+ sebesar 40 dan 50 mg/L dan penambahan Fe 2+ /Zn 2+ sebesar 0,5; 1,5 dan 2,5 mg/L. Isolasi dan identifikasi konsorsium bakteri pada kondisi optimum operasional reaktor menggunakan 16S rRNA. I.5 Hipotesis Penelitian Kondisi lingkungan (pH, penambahan Fe 2+ dan Zn 2+ ) dan flushinggas N 2 dapat menggeser jalur biodegradasi limbah cair sehingga meningkatkan etanol yang dihasilkan oleh bakteri kultur campuran anaerob. I.6 Kebaruan Penelitian Penelitian proses pengolahan anaerob telah berkembang ke arah rekoveri produk- produk yang terbentuk pada tahap asidogenesa karena waktu proses yang jauh lebih singkat dibandingkan tahap metanogenesa. Beberapa parameter yang mempengaruhi pembentukan produk asidogenesa seperti pengendalian pH, flushing gas N 2 dan penambahan ion logam telah dilakukan oleh peneliti-peneliti 7 sebelumnya untuk melihat pengaruhnya ke pembentukan produk asam volatil dan belum spesifik ke arah pembentukan etanol oleh kultur campuran bakteri anaerob. Pengaruh pH terhadap pembentukan etanol, asam lemak volatil dan bioH 2 oleh kultur campuran bakteri anaerob telah dilakukan oleh Ren dkk., 2007; Wang dkk., 2006; Ren dkk., 2006 dan Ren dkk., (1997). Dari hasil penelitian diketahui bahwa fermentasi molases pada pH 4-4,5menghasilkan etanol dan asetat sebagai produk utama fermentasi dan menghambat pembentukan propionat dan butirat. Pada fermentasi glukosa, etanol tertinggi terbentuk pada pH 5,5-6 (Fang dan Liu, 2002); rentang pH 4-7 tidak berpengaruh terhadap terhadap pembentukan etanol pada substrat gelatin (Yu dan Fang, 2003) dan fermentasi gliserol menghasilkan etanol tertinggi pada pH 8 (Temudo dkk., 2007). Sedangkan pada kompleks subtrat yang mengandung pati, gelatin dan minyak/lemak dan limbah cair industri minyak sawit fokus penelitian ditujukan pada pembentukan asam lemak volatil (Ahmad, 2001; Hassan dkk., 1996; Hassan dkk., 1997a). Penambahan trace elemen (Fe dan Zn) untuk pembentukan etanol lebih banyak diteliti pada kultur murni yang tergolong penghasil etanol seperti S. cerevisiae; C. ragsdalei; C. thermohydrosulfuricum, Z. mobilis, Thermophilic anaerobic, T. ethanolicus (JW200); T. thermohydrosulfuricushydrogen producing bacteri HPB B49 (Saxena dan Tanner, 2010; Dabrock dkk., 1995; Yamashita, dkk 2008;Leite dkk., 2000; Avci dan Domnez, 2006; Zhao dkk., 2009; Leite dkk., 2000; Park dkk., 1992; Azenha dkk., 2000; Wang dkk., 2007; Chotineeranat dkk., 2010). Sedangkan pada kultur campuran pengaruh Fe 2+ dan Zn 2+ ditujukan untuk pembentukan asam volatil (Yenigun dkk., 2006; Yu dan Fang 2001) dan bioH 2dari glukosa (Wang dan Wan, 2008; Zheng dan Yu, 2004; Lee dkk., 2001) dan belum difokuskan ke pembentukan etanol. Upaya pengendalian jalur metabolisme bakteri campuran anaerob dengan flushinggas N 2 ditujukan untuk mengoptimal pembentukan asam asetat (Syafila dkk., 1998; Fynn dan Syafila, 1990); bioH 2 (Kim dkk., 2006; Mizuno dkk., 2000). Syafila dkk., (2010) mencoba mempelajari pengaruh keberadaan oksigen dan tanpa oksigen dengan flushing N 2 pada pembentukan etanol dari limbah kakao. 8 Pada penelitian ini akan dipelajari pengaruh pengendalian pH, penambahan ion Fe 2+ dan Zn 2+ dan flushing gas N 2 terhadap pembentukan etanol dan pergeseran produk asidogenesa dari biodegradasi limbah cair artifisial yang mengandung pati, pepton dan minyak serta pengujian kondisi operasional optimum pada limbah cair industri minyak sawit, serta isolasi dan identifikasi konsorsium bakteri penghasil etanol. Gambaran penelitian yang pernah dilakukan dan yang akan dilakukan dapat dilihat pada Tabel I.1. Tabel I.1Posisi penelitian terhadap penelitian sebelumnya No Parameter Biomassa Substrat Target Produk Ref. 1 pH Bakteri kultur campuran Substrat tunggal : molases, glukosa, gelatin, gliserol Substrat kompleks : limbah cair industri minyak sawit dan limbah cair domestik Asetat, etanol, bioH2. Etanol dapat terbentuk pada rentang pH 4 -8. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dan 11 2 Flushinggas N2 Bakteri kultur campuran Limbah cair kakao dan industri minyak sawit Pembentukan asetat 12, 13 dan 14 Glukosa dan molases Pembentukan hidrogen, flushing gas N2 tidak mempengaruhi pembentukan etanol 15 dan 16 3 Fe 2+ dan Zn 2+ Kultur tunggal Kultur campuran Glukosa Glukosa Etanol Asam volatil 17, 18, 19, 20 21, 22 23,24,25 4 pH dan mikroaerasi Thrichoderma harzianum dan S. cerevisiae Limbah cair industri minyak sawit Etanol 26 dan 27 1. Temudo dkk. (2008); 2. Ren dkk. (2007); 3. Wang dkk. (2006); 4. Ren dkk. (2006); 5. Yu dan Fang (2003); 6. Yu dkk. (2003); 7. Fang dan Liu (2002); 8. Ren dkk. (1997); 9.