MEKANISME DAN STRATEGI KONTROL PEMBENTUKAN ETANOL SEBAGAI USAHA PEMANFAATAN KEMBALI LIMBAH CAIR YANG MENGANDUNG SENYAWA ORGANIK KONSENTRASI TINGGI DISERTASI Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari Institut Teknologi Bandung Oleh David Andrio NIM : 35309007 (Program Studi Teknik Lingkungan) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2014 i ABSTRAK MEKANISME DAN STRATEGI KONTROL PEMBENTUKAN ETANOL SEBAGAI USAHA PEMANFAATAN KEMBALILIMBAH CAIR YANG MENGANDUNG SENYAWAORGANIK KONSENTRASI TINGGI Oleh: David Andrio NIM: 35309007 Salah satu upaya untuk mengatasi permasalahan keterbatasan sumber bahan baku yang tidak tergolong bahan pangan dalam industri etanol Indonesia adalah dengan memanfaatkan limbah cair organik konsentrasi tinggi hasil aktivitas agro industri melalui proses asidogenesa.Jalur pembentukan etanol dapat dibedakan berdasarkan konversi langsung dan tidak langsung piruvat menjadi asetaldehid. Mikro organisme yang memiliki enzim piruvat dekarboksilase akan mengonversi langsung piruvat menjadi asetaldehid. Sementara itu, pada bakteri fermentatif anaerob, piruvat terlebih dahulu dikonversi menjadi asetil-KoA yang selanjutnya akan terkonversi menjadi asetaldehid, beserta asam-asam volatil yang dapat mengurangi pembentukan etanol. Tujuan penelitian ini adalah mempelajari mekanisme pembentukan etanol dan pergeseran pembentukan produk asidogenesa dari limbah cair organik artifisial dan limbah indutsri minyak sawit melalui pengendalian operasional circulating bed reactor.Optimasipembentukan etanol dilakukan dengan metode pengendalian pH, sterilisasi substrat influen, variasi flushing N 2 dan variasi penambahan Fe 2+ dan Zn 2+ . Kondisi optimum yang diperoleh akan diujicobakan pada limbah cair industri minyak sawit. Selanjutnya dilakukan isolasi dan identifikasi konsorsium bakteri dari reaktor dengan kondisi optimum pembentukan etanol. pH awal seluruh reaktor diatur dalam rentang 6-6,5. Konsentrasi etanol pada reaktor bakteri tanpa dan pengendalian pH substrat non steril berurutan sebesar 48,32 dan 50,22 mgCOD/L atau 23,11 dan 24,03 mg/L dan pada reaktor sterilisasi substrat dengan pengendalian pH tidak jauh berbeda, yakni 48,07 mgCOD/L 23,00.Pengendalian pH dan sterilisasi substrat berpengaruh terhadap peningkatan pembentukan asetat dan menghambat pembentukan laktat.Sebagai pembanding, diteliti juga pembentukan etanol oleh ragi. Pembentukan etanol pada substrat non steril tanpa dan dengan pengendalian pH serta pada reaktor substrat steril dengan pengendalian pH berurutan sebesar 60,91; 71,29 dan 138,94 mgCOD/L atau 29,14; 34.11 dan66.47 mg/L. Variasi flushing gas N 2sebesar 0; 0.15 dan 0,2 L/menit/Lcairanpada biodegradasi limbah cair organik artifisial menghasilkan etanol berurutan sebesar 44,09; 40,10; 27,17 mgCOD/L atau 21,09; 19,18 dan 13,00 mg/L. Flushing N 2dapat meningkatkan pembentukan asam asetat dengan menghambat pembentukan laktat, propionat dan butirat. Untuk meningkatkan pembentukan etanol dilakukan variasi penambahan Fe 2+ sebesar 40; 50; 100; 200 dan 400 mg/L dan penambahan Zn 2+ sebesar 0,5; 1,0; 1,5; 2,5 dan 5,0 mg/L pada flushing N 2 sebesar 0,2 L/menit/L cairan. Etanol tertinggi terbentuk sebesar 512,23 mgCOD/L atau 245,08 ii mg/L pada penambahan 40 mgFe 2+ /L dan 289,81 mgCOD/L atau 138,66 mg/L pada penambahan 1,5 mgZn 2+ /L. Dari percobaan ini diperoleh kondisi optimum adalah flushing N 2 sebesar 0,2 L/menit/Lcairan dan penambahan 40mgFe 2+ /L dan 1,5 mgZn 2+ /L. Kondisi optimum yang dari percobaan limbah artifisial diaplikasikan pada limbah cair industri minyak kelapa sawit. Pada pengujian flushing N 2 sebesar 0,2 L/menit/L cairandiperoleh etanol sebesar 749,51 mgCOD/Latau 358,62 mg/L dan 324,88 mgCOD/L atau 144,45 mg/L pada reaktor tanpa flushing N 2.Penambahan Fe 2+ sebesar 40 dan 50 mg/L diperoleh etanol berurutan sebesar 1614,87 mgCOD/L atau 772,66 mg/L dan 907,82 mgCOD/L atau 434,36 mg/L.Penambahan 0,5 mgZn 2+ /L pada 40 mgFe 2+ /L meningkatkan etanol menjadi 1840,24 mgCOD/L atau 880,50 mg/Ldan penambahan 0,5 mgZn 2+ /Lpada 50 mgFe 2+ /L menhasilkan etanol sebesar 2267,29 mgCOD/L atau 1084,83 mg/L. Pada kondisi optimum etanol dihasilkan, dilakukan isolasi dan identifikasi menggunakan teknik mikrobiologi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA. Konsorsium bakteri terdiri dari Clostridium sp.A1 (memiliki kedekatan dengan Clostridium tunisiense), Clostridium aciditolerans, Serratia marcescens dan Swine manure bacteria (memiliki kedekatan dengan Enterobacter asburiae). Secara umum, bakteri tersebut akan menghasilkan asam laktat, propionat, asetat dan etanol dalam jalur fermentasinya. Hasil penelitian menunjukkan kondisi optimum flushing N 2 sebesar 0,2 L/menit/Lcairan berhasil menekan pembentukanproduk piruvat (laktat dan propionat) dan mengarahkan jalur biodegradasi ke arah pembentukan produk asetil-KoA terutama asetat, namun tidak terjadi peningkatan pembentukan etanol. Peningkatan pembentukan etanol terjadi signifikan pada kondisi flushing N 2 sebesar 0,2 L/menit/Lcairandan penambahan 40 mgFe 2+ /L dengan peningkatan etanol dari 27,17 mgCOD/L atau 13.00 mg/L menjadi 512,23 mgCOD/L atau 245,08 mg/L. Kata kunci : etanol, asam lemak volatil, laktat, bakteri kultur campuran anaerob, Saccharomyces cerevisiae, pH, sterilisasi substrat, flushing N 2, ion Fe 2+ dan Zn 2+ , 16S rRNA. iii ABSTRACT MECHANISM AND CONTROLLING STRATEGY OF ETHANOL FORMATION AS RECOVERY HIGH STRENGTH ORGANIC WASTEWATER by David Andrio NIM: 35309007 One alternative to overcome limited sources of raw materials which are not classified as human food inethanol industries in Indonesia is to utilize high strength organic wastewater from agro industrial activities through acidogenesis process. Ethanol formation can divided into two pathways, namely a direct and an indirect conversion of pyruvic acid to acetaldehyde. Microorganismsproducing pyruvate decarboxylase enzymes convert pyruvate to acetaldehyde directly, while in anaerobic bacteria pyruvate is converted firstinto acetyl-CoA, then into acetaldehyde, and also into volatile acidswhich could reduce ethanol formation. The objectives of this research were to study the mechanism of ethanol formation and the shift of acidogenic products formation from artificial organic wastewater and palm oil mill effluent through the operational control of circulating bed reactor. Optimization ofethanol formation through pH control, substrate sterilization influent, N 2 flushing at several rates and addition of Fe 2+ and Zn 2+ at various different concentrationshave been performed in this study. The obtained optimum conditions were thenapplied in the palm oil mill effluent. Moreover,isolation and identification of bacterial consortiumfrom reactor at optimum condition for ethanol formation have been conducted. The initial pH for all reactorswere set in the range of 6-6.5 and the reactor weremaintained at similar pH range. Ethanol concentrations at pH controlled and non-pH controlled reactorswere 48.32 and 50.22 mgCOD/L or 23.12 and 24.23 mg/L, respectively, andit was found that at pH controlled and sterile substrate reactors produced similar ethanol concentration, (48.70 mgCOD/L or 23.30 mg/L). Control of pH and substrate sterilization could increase acetate formation and inhibit the lactate formation. As a comparison ethanol produced by Saccharomyces cerevisiaereactor was also investigated. As expected the S. cerevisiae reactor produced ethanol with concentration of 60.91; 71.29and138.94mgCOD/L or 29.14; 34.11 and 66.47 mg/L for non-sterile substrateswithout,andwithcontrol,andthesterilesubstratereactorwithpHcontrolsequ ence, subsequently. Biodegradation of artificial organic wastewater under N 2flushingat 0.0; 0.15 and0.2 L/min/L liquidproducedethanolwith concentrations of 44.09; 40.10; 27.17mgCOD/L or 21.10; 19.19 and 13.00 mg/L, respectively. N 2flushingcan increase aceticacidformation by reducinglactate, propionateandbutyrate synthesis. To increase the formation of ethanol, the additions of Fe 2+ at concentrations of 40; 50; 100; 200 and 400 mg/L, and Zn 2+ of 0.5; 1.0; 1.5; 2.5 and 5.0 mg/L with N 2flushing at 0.2 L/min/Lliquidhave been carried out. The highest ethanol iv concentration was obtained in reactor containing 40 mg/L Fe 2+ with ethanol concentration of 512.23 mgCOD/L or 245.09 mg/L, and the highest ethanol concentration with the value of 289.89 mgCOD/L or 138.70 mg/L was obtained in the presence of 1.5 mg/LZn 2+ . Taken together the optimum condition for ethanol production in artificial organic wastewater was at 0.2 L/min/L liquidN2 flushing, 40 mgFe 2+ /L, and 1.5 mgZn 2+ /L addition. The optimum condition obtained from artificial organic wastewaterwas applied to the palm oil mill effluent. Ethanol concentration produced in reactor flushed with N 2at the rate of flushing0.2 L/min/Lfluidwas 749.51 mgCOD/L or 358.62 mg/L, while ethanol concentration in reactor without flushing was 324.88 mgCOD/L or 144,45 mg/L.The addition of Fe 2+ at 40 and 50 mg/L resulted in ethanol formation of 1614.87 mgCOD/L or 772,66 mg/L and 907.82 mgCOD/L or 434,36 mg/L, respectively. The addition 0.5 mgZn 2+ /L in the presence of 40 mgFe 2+ /L increased the ethanol concentration with the value of 1840.24 mgCOD/L or 880,50 mg/L. Moreover,the addition of 50 mgFe 2+ /L + 0.5 mgZn 2+ /L led to further increase of ethanol formation with concentration of 2267.29 mgCOD/L or 1084,83 mg/L. Microorganisms involved in the biodegradation of high strength organic wastewater into ethanol at the optimum condition have been isolated and identified using molecular microbiology technique based on 16S rRNA genes. The bacterial consortium consists of Clostridium sp.A1with high similarity toClostridium tunisiense, Clostridium aciditolerans, Serratia marcecens bacteria and Swine manure bacteriumwhich is closedly related to Enterobacter asburiae. In general, these bacteria produce lactic, propionic, acetic acids and ethanol in their fermentation pathway. This study showed that the optimum condition of N 2flushing at 0.2 L/min/Lfluidreduced the formation of pyruvate product (lactate and propionate) and the biodegradation is directed towards the formation of acetyl-CoA products, especially acetate, butnotto an increase of ethanol formation. However, ethanol production under 0,2 L/min/L fluidof N2flushing significantly increased upon theaddition of 40mgFe 2+ /L, namely from 27.17mgCOD/L or 13.00 mg/L to 512.23mgCOD/L or 245.08 mg/L. Keywords: ethanol, volatile fatty acids, lactate, anaerobic mixed cultured bacteria, Saccharomycescerevisiae, pH, substratesterilization, N 2flushing, Fe 2+ andZn 2+ , 16SrRNA. v PEDOMAN PENGG UNAAN DISERTASI Disertasi Doktor yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh disertasi haruslah seizin Dekan Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. vi MEKANISME DAN STRATEGI KONTROL PEMBENTUKAN ETANOL DARI LIMBAH CAIR YANG MENGANDUNG SENYAWA ORGANIK KONSENTRASI TINGGI Oleh David Andrio NIM : 35309007 (Program Studi Teknik Lingkungan) Institut Teknologi Bandung Menyetujui Tim Pembimbing 3 Oktober 2014 Ketua (Prof. Dr. Ir. Mindriany Syafila, MS) Anggota Anggota (Dr. Dessy Natalia) (Dr.-Ing. Marisa Handajani, ST, MT) vii Dipersembahkan untuk: Ananda M. Titan Deannova dan M. Al Khemi Deannova beserta keluarga tercinta viii KATA PENGANTAR Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas seluruh karunia dan petunjuk-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan disertasi ini. Disertasi dengan judul “MEKANISME DAN STRATEGI KONTROL PEMBENTUKAN ETANOL SEBAGAI USAHA PEMANFAATAN KEMBALI LIMBAH CAIR YANG MENGANDUNG SENYAWA ORGANIK KONSENTRASI TINGGI ” merupakan salah satu syarat yang harus dilakukan untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Teknik Lingkungan, Program Pasca Sarjana Institut Teknologi Bandung. Penulis menyadari setulus hati bahwa terlalu sulit laporan penelitian ini dapat selesai tanpa adanya bantuan, dorongan, saran dan nasehat dari berbagai pihak. Untuk semua itu Penulis dengan tulus mengucapkan terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. Ir. Mindriany Syafila, MS, atas segala bimbingan arahan petunjuk serta meluangkan waktu pikiran beliau sehingga disertasi ini dapat terselesaikan. 2. Dr. Dessy Natalia dan Dr.-Ing. Marisa Handajani, ST, MT) atas segala bimbingan arahan petunjuk serta meluangkan waktu pikiran beliau sehingga disertasi ini dapat terselesaikan. 3. Dr. Herto Dwi Ariesyady, ST, MTselaku Ketua Prodi Sarjana Teknik Lingkungan Institut Teknologi Bandung serta timreviewer dan penguji sidang Disertasi. 4. Dr. Dwina Roosmini selaku Ketua Prodi Magister dan Doktor Teknik Lingkungan Institut Teknologi Bandung. 5. Ibu/Bapak staf Dosen Prodi Teknik Lingkungan yang telah mencurahkan ilmu kepada penulis. 6. Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan atas bantuan Beasiswa Program Pasca Sarjana Program Doktor. 7. Hibah Kelompok Keahlian ITB Tahun 2012 dan Hibah Disentralisasi DIKTI 2014 atas bantuan beasiswa serta pendanaan dalam penelitian ini. ix 8. Keluarga tercinta atas semua kesabaran dan pengertiannya, serta 9. Bapak/Ibu pegawai Prodi Teknik Lingkungan, serta teman-teman program doktor yang selalu memberikan dorongan moril selama penulis menyelesaikan program studi ini. Atas bantuannya yang sangat berharga dalam proses pembelajaran dan pendewasaan penulis, semoga ALLAH SWT membalas budi baik dan senantiasa mendapat lindungan-Nya. Karena keterbatasan ilmu dan pemahaman penulis, terlepas dari berbagai kekurangan yang ada semoga laporan disertasi ini bermanfaat bagi pengembangan penelitian selanjutnya. Bandung, Oktober 2014 David Andrio x DAFTAR ISI ABSTRAK ........................................................................................................ i ABSTRACT ...................................................................................................... iii PEDOMAN PENGGUNAAN DISERTASI ........................................................... v KATA PENGANTAR ......................................................................................... viii DAFTAR ISI ....................................................................................................... x DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xv DAFTAR TABEL ................................................................................................ xix I. PENDAHULUAN ......................................................................................... 1 I.1 Latar Belakang........................................................................................... 1 I.2 Perumusan Masalah Penelitian ..................................................................