19 Bab III Bahan dan Metode Penelitian III.1 Kerangka Penelitian Kerangka penelitian pada Gambar III.1 menunjukkan tahapan penelitian yang dibagi ke dalam 3 tahapan besar, yaitu (i) Seleksi biosurfaktan anionik, (ii) Uji adsorpsi Cd oleh biosurfaktan, (iii) Karakterisasi biosurfaktan dan Identifikasi Isolat, dan (iv) Optimasi Adsorpsi Cd oleh Biosurfaktan Terpilih. Gambar III. 1 Rancangan Penelitian Eksplorasi Biosurfaktan Indigen Untuk Aplikasi Agen Bioremediasi Logam Berat Kadmium III.2 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2019 sampai November 2021 di Laboratorium Mikrobiologi, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati (SITH), Institut Teknologi Bandung (ITB). 20 III.3 Alat dan Bahan III.3.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari alat gelas dan alat listrik. Alat gelas yang digunakan adalah Cawan Petri, Batang Oose, pembakar Bunsen, labu Erlenmeyer, labu ukur, tabung rekasi, gelas ukur, gelas kimia, termometer, vial kaca, pipet volume, mikropipet, pipet tetes, batang pengaduk, corong kaca, Botol Scott. Alat listrik yang digunakan adalah rotary shaker incubator, vortex, inkubator, autoklaf, refrigated centrifuge, penangas air, mikroskop cahaya, lemari pendingin, Tensiometer du Nuoy (Fisher), DropMaster DMs-401, FTIR Prestige 21 Shimadzu, Laminar Air Flow, pH meter, lemari asam, spektrometri masa MALDI- TOF, Spektroskopi Serapan Atom (SSA). Digunakan juga pembolong agar, penggaris, dan spatula. III.3.2 Isolat Bakteri Isolat bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebanyak 26 isolat yang diisolasi pada penelitian sebelumnya oleh Fahara, 2021 dari Sumur Minyak X, Jatibarang, Jawa Barat. Isolat-isolat bakteri yang diperoleh dilakukan pemurnian menggunakan metode 4-way streak pada media agar selektif SMSSe + 2% crude oil. Kemudian isolat-isolat tersebut dilakukan adaptasi pada suhu 37 o C dan 50 o C, serta diujikan kemampuannya dalam mendegradasi fraksi SARA. III.3.3 Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas media aktivasi dan media produksi biosurfaktan. Media aktivasi bakteri secara umum menggunakan Nutrien Broth (NB) dan Nutrient Agar (NA) dengan penambahan 1% (v/v) crude oil. Media produksi biosurfaktan, berupa medium Salt Mineral Stone Solution (SMSS) yang terdiri dari (per liter air destilasi) (Gudina dkk., 2011): NH 4NO3 (2,5 g); MgSO 4.7H2O (0,5 g); MnCl2.4H2O (0,2 g); CaCO3 (0,5 g); Na2HPO4.7H2O (1 g);32KH 2PO4 (0,5 g) dengan modifikasi penambahan 0,1 % ( w /v) ekstrak ragi, trace element (per 100 ml air destilasi); (FeSO 4.7H2O (0,01g), ZnSO4.7H2O (0,01 g), Na 2MoO4 (0,006 g), CuSO4.2H2O (0,001 g) pH diatur tetap 6,8 - 7 dan 2% ( v /v) crude oil sumur minyak Jatibarang sebagai sumber karbon. Pada uji muatan 21 biosurfaktan digunakan bahan larutan BaCl2 (50mM), CTAB (20mM), SDS(20mM), dan plate Agar (1% w /v). Pada Uji adsorpsi logam berat kadmium digunakan bubuk kadmium CdCl 2 dan air deion. III.3.4 Perangkat Lunak Pada penelitian ini digunakan analisis hasil pengamatan menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel 2013 dan rancangan percobaan serta analisis statistik menggunakan perangkat lunak Minitab 19.2020.1. III.4 Metode Kerja III.4.1 Peremajaan dan Persiapan Isolat Bakteri Sebanyak 26 isolat bakteri asal sumur minyak X Jatibarang yang telah diperoleh sebelumnya (Fahara, 2021) diremajakan pada media Nutrient Agar (NA) kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Isolat bakteri diinokulasi dalam NA miring dan disimpan dalam lemari pendingin (4 o C) sebagai biakan stok (stock culture). III.4.2 Produksi dan Ekstraksi Biosurfaktan Produksi biosurfaktan dilakukan dengan tahapan pre-produksi, yaitu dengan menginkubasi isolat-isolat yang diperoleh masing-masing ke dalam media NB selama 24 jam pada suhu 37 °C menggunakan shaker incubator pada kecepatan 150 rpm (rotation per minute) selama 24 jam. Setelah itu, sebanyak 10% (v/v) inokulum pre-produksi diinokulasi pada media produksi berupa 300mL media produksi. Media diinkubasi pada incubator shaker dengan kecepatan 150 rpm dan suhu 37° C selama 3 hari. Biosurfaktan dipanen melalui beberapa tahapan mengikuti metode yang dikembangkan oleh Smyth dkk. (2010) dengan sedikit modifikasi. Biomassa sel dipisahkan dari medium produksi dengan cara disentrifugasi pada 7500 rpm, 4 o C selama 15 menit. Tahapan produksi dilanjutkan dengan proses pemisahan sel bakteri dengan masing-masing supernatan untuk memisahkan biosurfaktan yang bersifat ekstraseluler dan terlarut di dalam supernatan. Lalu, supernatan 22 dicampurkan dengan larutan kloroform (p.a.):metanol (95%) dengan perbandingan 2:1 sebanyak 1X volume. Larutan dihomogenisasi kemudian dibiarkan hingga terbentuk 2 fasa. Bagian interfasa bawah (metanol) diambil kemudian diuapkan. Biosurfaktan yang terlarut dalam pelarut kloroform kemudian diuapkan dan hasil yang diperoleh merupakan ekstrak kasar biosurfaktan. Ekstrak biosurfaktan yang telah kering kemudian dilarutkan dalam deion. Ekstrak kasar biosurfaktan inilah yang masing-masing diujikan potensinya sebagai agen bioremediasi senyawa logam berat kadmium. III.4.3 Uji Muatan Biosurfaktan : Uji Double Diffusion Agar Muatan ionik dari biosurfaktan dapat ditentukan dengan teknik difusi agar. Teknik ini dilakukan dengan membuat 1% agar pada cawan petri dan diberi cetakan lubang/sumur yang disusun menjadi dua baris. Salah satu baris diisi dengan sampel biosurfaktan dan baris yang lain diisi dengan surfaktan yang telah diketahui muatan ioniknya. Agar dicetak dengan ketebalan 0,4 mm. Surfaktan anionik yang digunakan adalah Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) dengan konsentrasi 20 mM. Sedangkan, surfaktan kationik yang digunakan adalah barium klorida (BaCl 2) dan Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) dengan konsentrasi berturut-turut 50 mM dan 20 mM (Tabel III.1). Tabel III.1 Larutan kontrol beserta konsentrasinya pada uji muatan biosurfaktan No Larutan Konsentrasi Muatan 1 SDS 20mM Negatif 2 BaCl2 50mM Positif 3 CTAB 20mM Positif Tiap larutan uji berupa supernatant media produksi bakteri yang telah dipisahkan dari sel nya menggunakan teknik sentrifugasi, masing-masing dimasukkan ke dalam sumur dengan volume 25 μL. Kemudian, agar diinkubasi selama 48 jam pada 23 suhu ruang. Setelah itu, diamati keberadaan garis presipitat pada agar. Presipitat tersebut menunjukkan karakteristik ion dari biosurfaktan (Satpute dkk., 2010). Gambar III. 2 Ilustrasi letak larutan sampel biosurfaktan (X) dan larutan kontrol (BaCl2, CTAB dan SDS) pada uji muatan biosurfaktan. III.4.4 Uji Indeks Emulsifikasi (E24) Kemampuan aktivitas biosurfaktan dalam mengemulsifikasi minyak dapat ditentukan melalui pengukuran indeks emulsifikasi. Pengujian indek emulsifikasi dilakukan dengan cara minyak bumi dicampurkan ke dalam supernatan bebas sel yang telah dipisahkan dengan sentrifugasi (7500 rpm, 15 menit) dengan perbandingan 1:1 (v/v) (triplo). Selanjutnya dihomogenisasi dengan menggunakan vortex selama 2 menit. Setelah itu didiamkan selama 24 jam pada suhu 50 o C. Indeks emulsifikasi dihitung dengan mengukur tinggi emulsi dibagi dengan tinggi total cairan dalam kolom kemudian dikalikan 100% sehingga didapatkan nilai Ei/E 24 (Persamaan III.1) (Satpute a dkk., 2010). Angka Indeks Emulsifikasi (E 24) dihitung menggunakan rumus berikut : tv¨ L ÁØ Áç Tsrr¨ (III.1) dengan : E 24 = Indeks Emulsifikasi setelah inkubasi 24 jam *A = tinggi emulsi antara supernatant dan minyak yang terbentuk (cm) *P = tinggi total cairan di dalam tabung reaksi (cm) 24 III.4.5 Pengukuran Interfacial Tension (IFT) pada Biosurfaktan Uji IFT antara sampel supernatan dengan light oil diukur menggunakan Tensiometer du Nuoy. Prosedur pengukuran IFT menggunakan prinsip penggunaan du Nuoy ring disesuaikan dengan standar operasional penggunaan alat yang telah dibuat oleh Laboratorium tempat pengoperasian alat di Laboratorium Kimia Fisik, ITB.