50 Bab IV Hasil dan Pembahasan IV.1 Hasil IV.1.1 Profil Akumulasi Kriptobrakiton C IV.1.1.1 Profil Akumulasi Kriptobrakiton C Hasil MALDI-MSI Profil akumulasi kriptobrakiton C pada daun dilakukan menggunakan MALDI-MSI. Pengujian standar dilakukan untuk mengetahui massa kriptobrakiton C terhadap ion (m/z), dan diperoleh m/z kriptobrakiton C sebesar 288,14. Pengukuran kriptobrakiton C dengan metode MALDI-MSI menunjukkan nilai m/z untuk [M + H + ] (massa + ion H + ) sebesar 289,14. Spektrum yang dihasilkan tidak tajam dan masih banyak pengotor (Gambar IV.1) yang disebabkan karena proses ionisasi analit tidak maksimal. Oleh karena itu untuk mengoptimalkan ionisasi, dilakukan derivatisasi kriptobrakiton C dengan menggunakan senyawa Girard T (GT) (acethydrazide trimethylammonium chloride). Senyawa GT memiliki sifat mudah terionisasi oleh laser karena memiliki trimetilamin yang bermuatan positif (Shimma dkk., 2016). Pada reaksi derivatisasi, senyawa GT akan bereaksi dengan gugus keton pada rantai alifatik dari kriptobrakiton C (Gambar IV.2A) membentuk gugus imina. Selanjutnya, senyawa kriptobrakiton CGT pada saat dilakukan MS/MS melepaskan gugus trimetilamin, sehingga yang terdeteksi berupa senyawa dengan m/z 343,17. Hasil derivatisasi ini menunjukkan spektrum kriptobrakiton C yang diperoleh menjadi lebih tajam (tanpa pengotor) dan ion molekul senyawa kriptobrakiton C muncul pada m/z 343,17 (Gambar IV.2B). Selanjutnya, hasil pencitraan menunjukkan bahwa kriptobrakiton C terdistribusi di seluruh daun, mulai daun ke-1 sampai daun ke-5 dihitung dari pucuk (Gambar IV.3). Pada hasil pencitraan tersebut intensitas relatif kriptobrakiton yang paling tinggi pada spektrum MALDI-MSI ditunjukkan dengan warna merah, sementara intensitas relatif terrendah ditunjukkan dengan warna biru. Dari data tersebut terlihat bahwa intensitas relatif kriptobrakiton C yang tertinggi ada pada daun ke-2 (Gambar IV.4) dan intensitas relatif terrendah ada pada daun ke-5. Foto 51 daun asal menunjukkan kondisi daun sebelum diderivatisasi oleh GT dan diberi matriks α-CHCA. Gambar IV.1 Kriptobrakiton C dalam bentuk [M+H + ] (289,14 m/z) (tanda panah tebal), Puncak yang terdeteksi tidak tajam dan banyak pengotor (lingkaran merah). Gambar IV.2 Derivatisasi kriptobrakiton C dengan Girard T, menghasilkan senyawa dengan m/z 343,17 setelah dilakukan MS/MS. Gambar IV.3 Daun ke-I s.d ke-5 C. pulchrinervia  P]     [  1 2 3 4 5 A B Intensitas relatif Intensitas relatif 52 Foto spektrum MALDI-MSI juga menunjukkan bahwa intensitas relatif kriptobrakiton C terakumulasi pada jaringan mesofil namun tidak terakumulasi pada jaringan pembuluh. Foto overlay menunjukkan posisi spektrum pada posisi daun yang dianalisis. Sebagai kesimpulan, spektrum dari kriptobrakiton C secara kualitatif menunjukkan bahwa akumulasi kriptobrakiton C terdapat di semua daun (Gambar IV.4 F) dengan urutan penurunan intensitas relatif kriptobrakiton C tersebut yaitu pada daun ke-2, kemudian daun ke-1, 3, 4, dan 5. Gambar IV.4 Spektrum kriptobrakiton C pada daun ke-1 sampai daun ke-5 yang dianalisis menggunakan MALDI-MSI (A-E). Intensitas relatif kriptobrakiton C paling tinggi berada pada daun ke-2 (F). 53 0 25 50 75 100 125 150 12345 Kriptobrakiton C (mg) DAUN IV.1.1.2 Akumulasi Kriptobrakiton C Hasil GC-MS Hasil dari pengukuran kriptobrakiton C menggunakan GC-MS, menunjukkan bahwa puncak standar senyawa kriptobrakiton C ada pada waktu retensi 10,047 (Gambar IV.6A). Selanjutnya, hasil pengukuran kriptobrakiton C secara kuantitatif menunjukkan bahwa kriptobrakiton C yang terakumulasi memiliki pola yang sama dengan uji kualitatif, yaitu akumulasi kriptobrakiton C yang terbanyak ada pada daun ke-2, kemudian pada daun ke-1,3,4, dan 5 (Gambar IV.5). Gambar IV.5 Jumlah kriptobrakiton C (mg) pada daun ke-1,2,3,4 dan 5 Gambar IV.6 Spektrum GC-MS standar kriptobrakiton C berada pada waktu retensi 10,047 yang ditunjukkan oleh anak panah (A), dan spektrum GC-MS kriptobrakiton C pada daun ke-5 pada waktu retensi 10,047 (B). 8.809.009.209.409.609.8010.0010.2010.4010.6010.8011.00 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 Time--> Abundance TIC: SAMPEL 2.D\DATA.MS 9.057 9.150 9.505 9.646 10.046 10.197 10.331 10.391 10.450 10.852 11.007 A B 54 IV.1.2 Hasil Isolasi Kriptobrakiton C Pada penelitian ini, sampel daun yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor sebanyak 4 kg berat basah, kemudian dikeringkan dan dibuat menjadi serbuk dengan berat 1,88 kg. Serbuk daun kering diekstraksi dengan aseton, dipisahkan klorofilnya sehingga diperoleh ekstrak daun bebas klorofil. Proses pemisahan, pemurnian esktrak daun bebas klorofil dengan teknik kromatografi serta diikuti dengan kristalisasi menghasilkan kristal putih kekuningan dengan berat 75 mg (3,9 x 10 -3 %) (Gambar IV.7). Gambar IV.7 Kristal kriptobrakiton C (A) dan struktur kimianya dengan Mr 288,14 (B) IV.1.2.1 Indeks Aktivitas Antioksidan Kriptobrakiton C Hasil pengujian antioksidan kriptobrakiton C menggunakan DPPH dengan variasi konsentrasi kriptobrakiton C 2, 5, 10, 20, 40, 80 dan 160 ppm, menunjukkan bahwa senyawa kriptobrakiton C memiliki IC50 sebesar 884,7 ppm. Nilai IC50 kriptobrakiton C dihitung dari grafik persentase inhibisi terhadap log konsentrasi kriptobrakiton C yang digunakan. Aktivitas antioksidan AAI diukur berdasarkan konsentrasi final DPPH yang digunakan dibagi dengan IC50 kriptobrakiton C sehingga diperoleh AAI sebesar 0,57. Berdasarkan standar kategori AAI (Antioxidant Activity Index) (Scerer, 2009), nilai AAI sebesar 0-0,5 dikategorikan rendah, AAI sebesar 0,5-1,0 dikategorikan sedang, AAI sebesar 1,0-2,0 dikategorikan kuat dan AAI >2,0 dikategorikan sangat kuat. Oleh karena itu kriptobrakiton C yang memiliki nilai AAI sebesar 0,57 memiliki aktivitas antioksidan dengan kategori sedang. A B Kriptobrakiton C Kriptobrakiton C (Juliawaty dkk.,2020) 55 IV.1.2.2 Sitotoksisitas Kriptobrakiton C Uji sitotoksik senyawa kriptobrakiton C terhadap lini sel kanker MCF-7 dan T47D menunjukkan bahwa nilai IC50 kriptobrakiton C terhadap sel kanker payudara MCF-7 sebesar 12,94 ± 0,32 μM (Tabel IV.1, terhadap sel T47D sebesar 65,33 ± 2,33 μM (Tabel IV.1) dan terhadap sel normal MRC-5 sebesar 122,57 ± 19,84 μM (Tabel IV.1). Berdasarkan kategori sitotoksik menurut Boik (2001) yang menyatakan bahwa konsentrasi senyawa alam murni dikategorikan sitotoksik dan bereaksi secara langsung terhadap sel kanker secara in vitro berada pada kisaran konsentrasi 0 sampai 50 μM. Oleh karena itu, berdasarkan acuan tersebut maka aktivitas kriptobrakiton C terhadap sel MCF-7 berada pada kategori sitotoksik. Nilai IC50 tersebut masih lebih tinggi dibandingkan dengan senyawa doxorubicin yang digunakan sebagai kontrol positif yang memiliki IC50 sebesar 0,9 μM Pada sel MCF-7. Nilai IC50 kriptobrakiton C berbeda secara nyata dibandingkan dengan nilai IC25 dan IC75 (p