34 Bab III Metode Penelitian Penelitian profil akumulasi kriptobrakiton C menggunakan metode mass spectrometry MALDI-MSI dan GC-MS. Sementara itu, isolasi kriptobrakiton C dari daun C. pulchrinervia dilakukan menggunakan metode esktraksi dan berbagai teknik kromatografi untuk pemisahan dan pemurnian. Pengkajian kemampuan antioksidan dilakukan dengan menggunakan DPPH dan analisis sifat sitotoksik menggunakan metoda MTT. Metode yang digunakan untuk mengkaji potensi antikanker kriptobrakiton C terhadap proliferasi sel adalah uji BrdU. Pengkajian sifat kriptobrakiton C terhadap induksi apoptosis diuji menggunakan metode kolorimetri annexin V/PI-FITC. Adapun untuk menguji efek kriptobrakiton C terhadap migrasi sel digunakan metode Boyden Chamber, dan pengujian efek kriptobrakiton C terhadap kemampuan sel untuk membentuk koloni digunakan uji klonogenik. Sel uji yang digunakan adalah lini sel kanker payudara MCF-7 dan T47D, yang responsif terhadap reseptor estrogen dan progesteron. Untuk mengetahui kemampuan kriptobrakiton C dalam memimik sifat estrogen, dilakukan uji YES (Yeast Estrogen Screen), uji lusiferase dan uji BCA (Bicinchoninic Acid). III.1 Profil Akumulasi Kriptobrakiton C Metode untuk menganalisis akumulasi kriptobrakiton C secara kualitatif in situ pada daun C. pulchrinervia menggunakan mass spectrometry MALDI‐MSI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry Imaging). Metode MALDI‐MSI dapat melakukan visualisasi intensitas relatif akumulasi senyawa pada sampel daun. Senyawa tersebut diuraikan berdasarkan massanya (m/z) oleh mass analyser dan dideteksi oleh detektor (Dong dkk., 2016 dan Zhang dkk., 2019). Adapun analisis kuantitatif kriptobrakiton C pada daun dilakukan menggunakan GC- MS (Gas Chromatography- Mass Spectrometry). III.1.1 Tempat Penelitian Analisis akumulasi kriptobrakiton C pada daun secara in situ dilakukan di Laboratorium Shimadzu, Department of Biotechnology Graduate School of Engineering, Osaka University, Jepang . Sementara itu, analisis kuantitatif 35 kriptobrakiton C dilakukan menggunakan alat GC-MS di Pusat Laboratorium Forensik (Puslabfor) Mabes Polri Jakarta. III.1.2. Bahan Penelitian Pada pengkajian profil akumulasi kriptobrakiton C digunakan sampel daun segar C. pulchrinervia yang diperoleh dari Kebun Raya Bogor yang selanjutnya disimpan dalam kondisi vakum pada suhu 4 o C. Adapun matriks yang digunakan pada pengukuran MALDI-MSI adalah α-CHCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) (Sigma) dan senyawa Girard T(GT) (Sigma) yang terdapat di Laboratorium Shimadzu, Department of Biotechnology Graduate School of Engineering, Osaka University. Ekstrak daun C. pulchrinervia dan senyawa kriptobrakiton C murni diperoleh dari tahapan ekstraksi sampel daun yang dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, (KOBA) Program Studi Kimia, FMIPA-ITB. III.1.3 Persiapan Sampel untuk MALDI MSI Daun segar C. pulchrinervia dipanen dari pohon C. pulchrinervia var. Sumatrana di Kebun Raya Bogor. Kutikula abaksial daun dihilangkan dengan cara dikerik. Sisi adaksial daun dengan posisi paradermal ditempelkan pada gelas objek Indium Tin Oxide (ITO glass) menggunakan double tape konduktif. Preparat yang sudah terbentuk selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung Falkon TM 50 mL yang berisi silika gel dan disimpan pada suhu 4 o C. Tahapan pada pengukuran sampel dengan MALDI-MSI ditunjukkan pada Gambar III.1. III.1.4 Derivatisasi Kriptobrakiton C untuk Pengukuran MALDI-MSI Proses derivatisasi kriptobrakiton C dilakukan untuk mengefektifkan proses ionisasi kriptobrakiton C sehingga dapat dideteksi secara maksimal pada alat MALDI-MSI. Derivatisasi senyawa kriptobrakiton C menggunakan senyawa Girard T (GT) (10 mg/mL dalam 20% asam asetat) (Shimma, 2016). Senyawa GT disemprotkan pada sampel yang sudah ditempelkan pada ITO (Indium Tin Oxide) glass menggunakan artist’s air brush (PS-270, GSI Creos, Tokyo, Japan). Sebelum disemprot GT, sampel tersebut difoto terlebih dahulu menggunakan MALDI-MSI untuk visualisasi sampel sebelum diberi perlakuan. Setelah disemprot senyawa GT, 36 sampel disimpan pada suhu ruang selama 60 menit, dan selanjutnya diberi perlakuan matrik α-CHCA. III.1.5 Aplikasi Matriks untuk MALDI-MSI Aplikasi matriks dilakukan dengan dua teknik, yaitu sublimasi dan semprot. Sublimasi dilakukan menggunakan iMlayer (SVC-700TMSG, Sanyu Electron,Tokyo, Japan) dengan matrik α-CHCA (α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid). Adapun teknik semprot dilakukan menggunakan artist’s air brush (PS-270, GSI Creos, Tokyo, Japan), dengan matriks yang sama. Penyemprotan matrik dilakukan secara bertahap pada jarak 8 cm dari permukaan sampel. Setelah pemberian matriks, sampel dikeringkan pada suhu ruang, kemudian diamati menggunakan instrumen MALDI-MSI (iMscope TRIO Shimadzu). Tahapan pada pengukuran sampel dengan MALDI-MSI ditunjukkan pada Gambar III.1. III.1.6 GC-MS Teknik GC-MS dilakukan pada masing-masing ekstrak daun C. pulchrinervia yang diperoleh dengan cara melakukan maserasi daun 1,2,3,4 menggunakan aseton. Hasil maserasi kemudian dipisahkan klorofilnya mengunakan metanol-air. Daun yang diekstrak berasal dari pohon yang sama. Sampling daun 1,2,3,4 dan 5 dilakukan sebanyak 3 kali. Pada pengukuran GC-MS ini digunakan senyawa kriptobrakiton C yang telah dimurnikan sebelumnya sebagai standar, dan pengukuran sampel dilakukan sebanyak tiga ulangan. Akumulasi senyawa kriptobrakiton C secara kuantitatif tersebut diukur menggunakan pelarut etil asetat pada alat GC-MS (6890 GC) dengan kolom Agilent 19091S-433 HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane, pada suhu maksimal 325 o C, dengan kecepatan 36 cm/detik. Tahapan pengukuran sampel ekstrak daun menggunakan teknik GC-MS ditunjukkan pada Gambar III.1. Adapun analisis kuantitatif kriptobrakiton C menggunakan SPSS 25.