POTENSI KRIPTOBRAKITON C YANG TERDAPAT PADA DAUN CRYPTOCARYA PULCHRINERVIA SEBAGAI ANTIKANKER PADA LINI SEL KANKER PAYUDARA MCF-7 DAN T47D DISERTASI Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari Institut Teknologi Bandung Oleh JUJUN RATNASARI NIM: 30616001 (Program Studi Doktor Biologi) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG DESEMBER 2021 i ABSTRAK POTENSI KRIPTOBRAKITON C YANG TERDAPAT PADA DAUN CRYPTOCARYA PULCHRINERVIA SEBAGAI ANTIKANKER PADA LINI SEL KANKER PAYUDARA MCF-7 DAN T47D Oleh Jujun Ratnasari NIM : 30616001 (Program Studi Doktor Biologi) Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki biodiversitas tertinggi. Tumbuhan asli Indonesia banyak yang memiliki khasiat sebagai tumbuhan obat dan telah dimanfaatkan oleh masyarakat secara tradisional. Salah satu tumbuhan asli Indonesia adalah genus Cryptocarya yang dikenal dengan nama lokal Medang atau Huru. Beberapa spesies Cryptocarya telah dilaporkan memiliki senyawa aktif dan satu di antaranya adalah spesies C. pulchrinervia yang merupakan tumbuhan asli yang tumbuh di daerah Sumatera, Kalimantan dan Papua. Salah satu senyawa piron yang terdapat pada C. pulchrinervia yaitu kriptobrakiton C telah dilaporkan memiliki sifat sitotoksik pada lini sel leukemia murin P-388 dengan IC50 3,03 Pg/mL (12,71 μM), tetapi profil akumulasi kriptobrakiton C pada daun C. pulchrinervia serta potensinya sebagai antikanker terutama pada lini sel kanker payudara MCF-7 dan T47D belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengkaji dan menganalisis profil akumulasi kriptobrakiton C pada daun C. pulchrinervia serta potensinya sebagai antikanker pada lini sel kanker payudara MCF-7 dan T47D. Adapun penelitian ini dilakukan dalam dua bagian. Bagian 1; yaitu analisis profil akumulasi kriptobrakiton C pada daun C. pulchrinervia menggunakan metode mass spectrometry MALDI-MSI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry Imaging) dan GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Bagian 2; yaitu isolasi kriptobrakiton C, analisis antioksidan dengan metode DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), analisis sitotoksisitas kriptobrakiton C terhadap lini sel kanker payudara MCF-7 dan T47D menggunakan uji MTT (3-(4,5- dimetilthiazol-2-yl)-2,5-di-fenil- tetrazolium bromida), analisis uji antiproliferasi dengan menggunakan BrDu- ELISA (5-bromo-2’-deoxiuridin-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), uji apoptosis menggunakan uji fluoresens annexin/PI-FITC serta flow-cytometry, uji migrasi sel menggunakan Boyden Chamber serta uji klonogenik untuk mengetahui kemampuan sel dalam membentuk koloni. Hasil kajian profil akumulasi secara kualitatif menunjukkan bahwa intensitas relatif kriptobrakiton C paling banyak diakumulasikan pada jaringan mesofil daun yang muda, yaitu daun ke-2 dibandingkan daun lainnya berdasarkan umur fisiologis. Hal tersebut sejalan dengan hasil uji kuantitatif yang menunjukkan akumulasi kriptobrakiton C paling tinggi ada pada daun muda sebesar 87,07 ± 47,21 mg. Hasil uji antioksidan ii menunjukkan bahwa kriptobrakiton C memiliki kategori aktivitas antioksidan yang sedang dengan indeks AAI 0,57. Sementara itu, uji MTT menunjukkan bahwa IC50 kriptobrakiton pada lini sel MCF-7 sebesar 12,94 ± 0,32 μM, IC50 pada lini sel T47D sebesar 65,33 ± 2,33 μM serta IC50 pada sel normal MRC-5 sebesar 122,57 ± 19,84 μM. Hal tersebut menunjukkan bahwa kriptobrakiton C bersifat sitotoksik terhadap lini sel MCF-7. Hasil uji proliferasi menunjukkan bahwa pada IC50 kriptobrakiton C dapat menghambat proliferasi sel MCF-7 sebesar 29,33 ± 21,20% setelah 12 jam perlakuan. Sementara itu, IC50 kriptobrakiton C dapat menghambat proliferasi sel T47D sebesar 51,42 ± 3.31%. Hasil apoptosis menunjukkan bahwa IC50 kriptobrakiton C pada sel MCF-7 dapat menginduksi apoptosis awal sel sebesar 14,75 ± 1,39%, dan IC50 kriptobrakiton C pada sel T47D dapat menginduksi apoptosis awal sebesar 14,17 ± 2,64%. Adapun uji migrasi menunjukkan bahwa IC50 kriptobrakiton C pada sel MCF-7 dapat menghambat migrasi sel sebesar 72,41 ± 9,27% dan IC50 kriptobrakiton C pada sel T47D dapat menghambat migrasi sel sebesar 57,69 ± 4,16%. Selain itu, berdasarkan hasil uji klonogenik IC50 kriptobrakiton C pada lini sel MCF-7 dapat menghambat pembentukan koloni sel dengan surviving fraction (SF) sebesar 0,32 ± 0,04, sedangkan IC50 kriptobrakiton C pada lini sel T47D dapat menghambat pembentukan koloni dengan SF sebesar 0,55 ± 0,12. Dari semua uji dalam penelitian tersebut maka dapat dinyatakan bahwa data akumulasi kriptobrakiton C pada daun muda tersebut merupakan informasi yang penting yang dapat dimanfaatkan dalam pemilihan sampel daun untuk memaksimalkan isolasi kriptobrakiton C dari daun, serta juga dapat digunakan untuk pengembangan produksi kriptobrakiton C secara in vitro. Selain itu, sifat sitotoksik kriptobrakiton C terhadap lini sel MCF-7, menunjukkan bahwa kriptobrakiton C memiliki potensi sebagai antikanker pada MCF-7. Kata kunci: Cryptocarya pulchrinervia, kriptobrakiton C, antiproliferasi, apoptosis, migrasi sel, klonogenik. iii ABSTRACT THE POTENCY OF CRYPTOBRACHYTONE C IN CRYPTOCARYA PULCHRINERVIA LEAVES AS ANTICANCER IN MCF-7 AND T47D BREAST CANCER CELL LINES By Jujun Ratnasari NIM : 30616001 (Doctoral Program in Biology) Indonesia is one of the countries in the world’s that has highest biodiversity. Many indigenous plants of Indonesia have properties as medicinal plants that have been used traditionally. One of those plants is Cryptocarya, known by the local name as Medang or Huru. Several Cryptocarya species have been reported to have bioactive compounds, and one of these is Cryptocarya pulchrinervia, an indigenous species to the Sumatera, Kalimantan, and Papua regions. One bioactive compound isolated from the leaves of Cryptocarya pulchrinervia is cryptobrachytone C, which showed cytotoxic activity against the murine leukemia P-388 cell line with an IC50 of 3.03 mg/mL (12.71 μM). However, the accumulation of this compound in the leaves of C. pulchrinervia and the potency of its compound as an anti-cancer agent in breast cancer cell lines, particularly against MCF-7 and T47D breast cancer, have not been reported yet. Therefore, the objective of this research was to investigate the accumulation of C. pulchrinervia in the leaves and the potency of cryptobrachytone C as an anti-cancer in breast cancer MCF-7 and T47D cell lines. The research was conducted in two-parts. The first part is the analysis of the accumulation profile of cryptobrachytone C in leaves of C. pulchrinervia using MALDI-MSI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry Imaging) and GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). The second part is cryptobrachytone C isolation, analysis of the antioxidant using the DPPH (2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl) test and analyzes the cytotoxic activity of the compound against MCF-7 and T47D cell lines using MTT (3-(4,5- dimetilthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl-tetrazolium bromide), then analyze the potency of cryptobrachytone C as anti-cancer, using BrdU-ELISA (5-Bromo-2’-deoxyuridine Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) for cell proliferation, annexin/PI staining with flow cytometry for the apoptosis test, Boyden Chamber method for migration test and clonogenic test for analyzing the cell capability to make a colony. The results showed that cryptobrachytone C was accumulated with the highest relative intensity in young leaves (in 2nd leaves) compared to the other leaves, based on physiological age. The highest quantitative of cryptobrachytone C was also in young leaves, amounting to 87.07 ± 47.21 mg. Besides that, the antioxidant test showed that cryptobrachytone C has mild antioxidant activity with an AAI index of 0.57. Meanwhile, the MTT test displayed that its cytotoxicity against the MCF-7 cell line with IC50 of 12.94 ± 0.32 μM but not against the T47D cell line with IC50 of 65.33 ± 2.33 μM, and it was non-toxic to the normal cell line MRC-5 with IC50 iv of 122.57 ± 19.84 μM. The proliferation test indicated that the IC50 of cryptobrachytone C in MCF-7 cell line can inhibit cell proliferation by an amount of 29.33 ± 21.20% after 12-hour treatment, but its IC50 in T47D cell line can inhibit cell proliferation by an amount of 51.42 ± 3.31%. The result of the apoptosis test revealed that the IC50 of cryptobrachytone C in MCF-7 cell line induced early apoptotis 14.75 ± 1.39%, and its IC50 in T47D cell line induced early apoptotis 14.17 ± 2.64%. The migration test revealed that the IC50 of cryptobrachytone C in MCF-7 cell line can inhibit cell migration by 72.41 ± 9.27%, while the IC50 of cryptobrachytone C in T47D cell line can inhibit cell migration 57.69 ± 4.16%. According to clonogenic test results, the IC50 of cryptobrachytone C in MCF-7 cell line can inhibit colony formation with a surviving fraction (SF) of 0.32 ± 0.04 while its IC50 in T47D cell line can inhibit colony formation with SF of 0.55 ± 0.12. From all of the results of the tests, it can be concluded that the accumulation profile of cryptobrachytone C in young leaves of C. pulchrinervia was important information that can be used to gain maximum isolation of cryptobrachytone C from the leaves.