17 Bab III Metodologi Penelitian III.1 Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2021 – Oktober 2022 di Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Unila. III.2 Desain Penelitian Penelitian dilakukan dengan rancangan acak lengkap (RAL) dengan lima kali ulangan pada setiap kelompok uji. Faktor yang diuji berupa kadar larutan ekstrak akuades Praxelis clematidea dengan konsentrasi 25%, 50%, dan 75%. Pembanding yang digunakan berupa akuades dan diuron (Karmex 80WP). Penggunaan diuron (C9H10Cl2N2O) menyesuaikan dengan konsentrasi yang dianjurkan sebesar 3%. III.3 Metode Penelitian Penelitian dilakukan dalam 3 bagian, yaitu analisis metabolit sekunder Praxelis, bioassay biji Asystasia, dan toksisitas ekstrak Praxelis pada kecambah Asystasia (Gambar III.1). Tumbuhan Praxelis dan biji Asystasia diperoleh dari lahan perkebunan kelapa sawit di Provinsi Lampung. 18 Gambar III. 1 Diagram alir penelitian. Perkecambahan Percobaan III Toksisitas Ekstrak Praxelis pada Kecambah Asystasia Pertumbuhan LC50 Hasil yang diharapkan, diperoleh: (1)Kandungan metabolit sekunder; (2) Efek toksik pada gulma; (3) Konsentrasi yang efektif Percobaan II Bioassay Biji Asystasia Perlakuan Akuades (Kontrol) Ekstrak Diuron Konsentrasi 3% Konsentrasi 25%; 50%; dan 75% Perkecambahan Pertumbuhan (a) Daya Kecambah; (b) Laju Perkecambahan; (c) Morfologi Biji dan Kecambah (a) Daya Tumbuh; (b) Jumlah Daun; (c) Biomassa; (d) Kandungan Klorofil; (e) Morfologi Kecambah Penapisan Fitokimia Uji Tabung Percobaan I Analisis Metabolit Sekunder Praxelis Uji KLT 19 Bioassay pada perkecambahan dan pertumbuhan biji Asystasia diletakkan dengan susunan seperti tampak pada Gambar III.2. Gambar III. 2 Tata letak percobaan potensi ekstrak Praxelis clematidea terhadap biji Asystasia gangetica: (K) kontrol (akuades); (D) diuron; (B) bioherbisida; (U1-5) ulangan; (K0) konsentrasi 0%; (D1) konsentrasi 3%; (B1) konsentrasi 25%; (B2) konsentrasi 50%; dan (B3) konsentrasi 75%. III.4 Prosedur Penelitian III.4.1 Preparasi Simplisia Seluruh bagian tumbuhan Praxelis (akar, batang, daun, dan bunga) dikumpulkan sebanyak 20 kg, kemudian dibersihkan melalui proses pencucian dan dikering- anginkan. Kemudian, Praxelis dibagi menjadi bagian atas (pucuk) yang terdiri dari batang, daun, dan bunga dan bagian bawah (akar) yang terdiri dari akar dan basal batang yang dipotong ±2 cm dari pangkal akar (dimodifikasi dari Thepphakhun & Intanon, 2020). Seluruh sampel tumbuhan selanjutnya dikeringkan dengan oven pada suhu 80 o C selama 48 jam (Wang dkk., 2021), dihaluskan menggunakan blender dan disaring menggunakan saringan No. 100 mesh untuk memperoleh serbuk halus. Kemudian, serbuk halus ditimbang menggunakan timbangan analitik untuk mengetahui biomassa keringnya dan dimasukkan ke dalam wadah tertutup untuk proses penyimpanan sebelum digunakan (Intanon dkk., 2020). III.4.2 Maserasi Simplisia Skema proses maserasi yang dilakukan ditunjukkan pada Gambar III.3. Serbuk halus mula-mula dimaserasi dengan pelarut akuades pada perbandingan 1:10 (g/mL) sebanyak tiga kali selama tiga hari (3 x 24 jam). Larutan ekstrak disaring B2U2 B2U4 K0U5 D1U4 B3U2 B3U5 D1U5 B3U3 B1U4 B2U3 K0U3 B3U4 D1U2 B2U1 B1U1 K0U4 D1U1 B1U5 B1U2 B3U1 B2U5 K0U1 B1U3 K0U2 D1U3 20 menggunakan dua helai kain katun (dimodifikasi dari Intanon dkk., 2020; Thepphakhun & Intanon, 2020). Filtrat yang diperoleh diuapkan di bawah tekanan tereduksi menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 40°C hingga pelarut telah menguap semuanya yang ditandai dengan berat ekstrak pekat yang konstan (Falcão dkk., 2013). Gambar III. 3 Skema proses maserasi. Setelah itu, hasil ekstrak dihitung nilai rendemennya dengan menggunakan persamaan III.1. ������������� (%)= ����� ������� ����� (������) ����� ������ (������) � 100 (III.1) (Truong dkk., 2019) III.4.3 Analisis Metabolit Sekunder Praxelis clematidea Penapisan senyawa kimia ekstrak akuades Praxelis dilakukan dengan dua cara, yaitu uji tabung dan uji kromatografi lapis tipis (KLT). III.4.3.1 Uji Tabung Uji tabung digunakan untuk mendeteksi kandungan senyawa kimia melalui perubahan warna, endapan, dan busa dengan cara sebagai berikut. Serbuk Halus Simplisia Residu Filtrat Maserasi dengan akuades Pemekatan Ekstrak 21 1) Flavonoid Ekstrak pekat sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 3 mL metanol, dan dikocok. Larutan dipanaskan dengan bunsen, kemudian ditambahkan serbuk Mg sebanyak 0,1g, HCl 2N sebanyak 2 tetes, dan 2 mL amil alkohol lalu dikocok dengan kuat dan didiamkan hingga larutan memisah. Apabila fraksi amil alkohol membentuk warna kuning, merah, atau jingga, maka ekstrak positif mengandung flavonoid (dimodifikasi dari Marjoni, 2022). 2) Alkaloid Ekstrak pekat sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 3 mL akuades, 3 mL kloroform, dan 2 mL amoniak 10% lalu dikocok. Selanjutnya, ke dalam larutan ditambahkan 2 mL H2SO4 pekat dan dikocok kembali. Kemudian, fase organik (kloroform) dipisahkan dari fase air dan fase organik ditambahkan reagen Dragendorff. Jika membentuk endapan merah atau jingga pada reagen Dragendorff, maka ekstrak positif mengandung alkaloid (dimodifikasi dari Marjoni, 2022). 3) Terpenoid Ekstrak pekat sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam corong pisah. Setelah ditambahkan 5 mL akuades dan 5 mL kloroform, kemudian ekstrak dikocok. Selanjutnya, fraksi kloroform dipisahkan ke dalam cawan porselin dan dibiarkan hingga mengering. Setelah penambahan reagen Lieberman-Burchard sebanyak 2- 3 tetes, warna ekstrak diamati. Jika terjadi warna cokelat, merah, atau ungu, menandakan ekstrak positif triterpenoid, sedangkan warna biru atau hijau menandakan ekstrak positif steroid (dimodifikasi dari Marjoni, 2022; Oleszek dkk., 2008). 4) Saponin Ekstrak pekat sebanyak 0,5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL air panas, dan kemudian dikocok dengan kuat secara vertikal selama 1 menit. Jika membentuk busa yang stabil dan tidak hilang setelah ditambahkan HCl 2N 22 selama 15 menit, maka ekstrak positif mengandung saponin (dimodifikasi dari Marjoni, 2022). Setelah itu, perubahan warna dan pembentukan endapan pada setiap perlakuan diamati dengan menggunakan aplikasi ImageJ-RGB. Pengamatan dilakukan dengan cara mengkuantifikasikan intensitas warna dari hasil gambar (foto) uji tabung untuk memperoleh nilai mean dan mode RGB. Nilai mean RGB menggambarkan kepekatan warna pada sampel. Rentang angka RGB adalah 0 sampai 255. Semakin mendekati angka 0, maka warna semakin gelap (hitam) dan semakin mendekati angka 255, maka warna semakin terang (putih). Sementara, nilai mode warna RGB memberikan kode warna. Analisis warna gambar secara terpisah, antara red (R), green (G), dan blue (B) akan menghasilkan tiga kode warna (Yoga, 2005). Kombinasi kode warna tersebut dikonversikan ke dalam kode RAL untuk merepresentasikan warna secara visual melalui RAL v.1.2.3 (Karapapa & Mcdonagh, 2019). Sementara, pembentukan busa diamati dengan cara mengukur tinggi busa menggunakan penggaris (Marjoni, 2022). III.4.3.2 Uji KLT Uji KLT digunakan sebagai prosedur lanjutan untuk mendeteksi komposisi bahan aktif dengan memisahkan senyawa-senyawa campuran yang tervisualisasikan dari keberadaan noda.