KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA α-AMILASE REKOMBINAN BmaN1 DARI Bacillus megaterium NL3 TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh Muhammad Akbar Thufail NIM: 20522001 (Program Studi Magister Kimia) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Juli 2023 KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA α-AMILASE REKOMBINAN BmaN1 DARI Bacillus megaterium NL3 BIOCHEMICAL PROPERTIES CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT α-AMYLASE BMAN1 FROM Bacillus megaterium NL3 TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh Muhammad Akbar Thufail NIM: 20522001 (Program Studi Magister Kimia) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Juli 2023 2 ABSTRAK KARAKTERISASI SIFAT BIOKIMIA α-AMILASE REKOMBINAN BmaN1 DARI Bacillus megaterium NL3 Oleh Muhammad Akbar Thufail NIM: 20522001 (Program Studi Magister Kimia) α-Amilase menghidrolisis ikatan α-1,4 glikosidik pada pati untuk menghasilkan oligosakarida. α-Amilase BmaN1 diisolasi dari Bacillus megaterium NL3 yang berasosiasi dengan anemon di Danau Laut Kakaban, Kalimantan. Berdasarkan kemiripan asam amino penyusunnya, BmaN1 diklasifikasikan ke dalam keluarga glikosida hidrolase (GH) 13 subkeluarga GH13_45. BmaN1 memiliki perbedaan residu katalitik lestari dari anggota subkeluarga GH13_45 lainnya. Perbedaan tersebut berupa pergeseran salah satu residu katalitik lestari aspartat ke posisi i+1 (Asp203), residu katalitik aspartat lainnya digantikan oleh histidin (His294), sedangkan glutamat tetap pada posisi lestarinya (Glu231). BmaN1 memiliki residu triptofan ganda pada pada heliks α3 yang diduga berperan dalam pengikatan pati. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kestabilan struktur protein dalam garam secara in silico, mengkarakterisasi sifat biokimia, dan menentukan aktivitas hidrolisis pati mentah oleh BmaN1. Karakterisasi kestabilan struktur BmaN1 dilakukan dengan metode dinamika molekul (MD) menggunakan aplikasi AMBER untuk mempelajari perubahan struktur protein pada berbagai kondisi suhu dan konsentrasi NaCl. Pada penentuan kestabilan struktur protein, digunakan mutan BmaN1 tanpa ujung-C (BmaN1ΔC) sebagai pembanding. Karakterisasi sifat biokimia BmaN1 dilakukan dengan penentuan aktivitas hidrolisis pati terlarut menggunakan metode DNS pada berbagai variasi kondisi suhu, pH, dan konsentrasi garam. Hasil pemodelan struktur BmaN1 dan BmaN1ΔC menunjukkan adanya residu triptofan yang diduga berperan dalam pengikatan pati, yaitu pada posisi 145, 154, 189, 190, dan 278. Berdasarkan nilai RMSD dan radius girasi, struktur BmaN1 dan BmaN1ΔC diperkirakan stabil pada konsentrasi NaCl 3,0 M. Namun, BmaN1 dan BmaN1ΔC memliki daerah sensitif garam pada residu 179 – 201 yang diketahui dengan peningkatan nilai RMSF pada saat ditambahkan NaCl. Hasil karakterisasi biokimia BmaN1 menunjukkan parameter kinetika K M dan V max sebesar 96,63 mg/mL dan 2.699 mg/menit, turnover number (k cat) sebesar 150.539/menit, dan efisiensi katalitik (k cat/KM) sebesar 25,96 mL/mg.s pada kondisi optimum 50°C dan pH 6,5. BmaN1 dapat menghidrolisis pati mentah jagung dan singkong dengan derajat hidrolisis masing-masing adalah 4,00% dan 4,22%. Aktivitas hidrolisis pati terlarut oleh BmaN1 menurun pada konsentrasi NaCl 0,5 M; 1,0 M; dan 2,0 M, masing-masing sebesar 52,83 %, 70,95 %, dan 83,19 %. Selain itu, penambahan inhibitor EDTA dan SDS sebanyak 10 mM juga menurunkan aktivitas hidrolisis pati oleh α-amilase BmaN1 masing-masing sebesar 59,98% dan 40,23%. Perubahan konformasi pada daerah pengikatan BmaN1 saat ditambahkan NaCl ditunjukkan dengan penuruan intensitas emisi fluoresensi triptofan. Kata kunci: α-amilase, BmaN1, karakterisasi, biokimia ABSTRACT BIOCHEMICAL PROPERTIES CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT α-AMYLASE BMAN1 FROM Bacillus megaterium NL3 By Muhammad Akbar Thufail NIM: 20522001 (Master’s Program in Chemistry) α-Amylase hydrolyzes α-1,4 glycosidic bonds in starch to produce oligosaccharides. α-Amylase BmaN1 was isolated from Bacillus megaterium NL3 associated with anemones in Kakaban Atoll, Kalimantan. BmaN1 is classified into the 13 glycoside hydrolase (GH) family, the GH13_45 subfamily based on its constituent amino acid compounds. BmaN1 has different conserved catalytic residues from other members of the GH13_45 subfamily. The difference of its conserved catalytic residues are a shift of nucleophilic aspartate residues to position i+1 (Asp203), replacement of transition state stabilizer aspartate by histidine (His294), while hydrogen bond donor glutamate residue remains in its conserved position (Glu231). BmaN1 has a double tryptophan residue on the α3 helix which predicted to contribute in raw starch binding. The aims of this study are to determine the stability of protein structure in salt using in silico approach, characterize its biochemical properties, and determine the activity of raw starch hydrolysis by BmaN1. The characterization of structural stability of BmaN1 was carried out by molecular dynamics (MD) method using the AMBER software to study changes in protein structure under various concentration of NaCl. In terms of protein structural stability, the BmaN1 mutant without the C-terminus end (BmaN1ΔC) was used as a comparison. Characterization of the biochemical properties of BmaN1 determined by soluble starch hydrolysis using the DNS method at various conditions of temperature, pH, and salt concentration. Structural modeling of BmaN1 and BmaN1ΔC showed the presence of tryptophan residues which are predicted to contribute in binding starch, namely at positions 145, 154, 189, 190, and 278. Based on the RMSD value and radius of gyration, the structures of BmaN1 and BmaN1ΔC are estimated to be stable at a NaCl concentration of 3.0 M. However, BmaN1 and BmaN1ΔC have salt sensitive regions at residues of 179 – 201 which are known from the increase in RMSF values when NaCl is added. Biochemical characterization of BmaN1 showed that the kinetic parameters of K M and V max were 96.63 mg/mL and 2,699 mg/minute, the turnover number (kcat) was 150,539/minute, and the catalytic efficiency (k cat/KM) was 25.96 mL/mg.s at optimum conditions of 50°C and pH 6.5. BmaN1 is able to hydrolyze raw corn and cassava starch with Degree of Hydrolysis (DH) at 4.00% and 4.22%, respectively. Hydrolysis activity of soluble starch by BmaN1 decreased at 0.5 M; 1.0M; and 2.0 M NaCl concentration, respectively 52.83%, 70.95% and 83.19%. Furthermore, the addition of EDTA and SDS inhibitors in concentration of 10 mM also reduced BmaN1 starch hydrolysis activity by 59.98% and 40.23%, respectively.