ENANSIOSELEKTIVITAS ISOLAT LIPASE HASIL PENDEKATAN METAGENOM TERHADAP (R,S)- ASAM MANDELAT DALAM REAKSI TRANSESTERIFIKASI DISERTASI Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari Institut Teknologi Bandung Oleh FENTI FATMAWATI NIM: 30516007 (Program Studi Doktor Kimia) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Juli 2023 ENANSIOSELEKTIVITAS ISOLAT LIPASE HASIL PENDEKATAN METAGENOM TERHADAP (R,S)- ASAM MANDELAT DALAM REAKSI TRANSESTERIFIKASI ENANTIOSELECTIVITY OF ISOLATE LIPASE FROM THE METAGENOM APPROACH TO (R,S)- MANDELIC ACID IN TRANSESTERIFICATION REACTIONS ABSTRAK ENANSIOSELEKTIVITAS ISOLAT LIPASE HASIL PENDEKATAN METAGENOM TERHADAP (R,S)- ASAM MANDELAT DALAM REAKSI TRANSESTERIFIKASI LK1, LK2 dan LK3 adalah gen lipase yang diperoleh dari hasil metagenom sampel kompos. Gen yang mengkode lipase ini telah disimpan di GenBank dengan nomor akses berturut-turut KP204883, KP204884, KP204885. Ekspresi gen lipase LK1, LK2 dan LK3 pada vektor ekspresi pET30a(+) dalam inang Eschericia coli yang diinduksi dengan IPTG dilakukan untuk memperoleh protein lipase rekombinan. Enantiomer asam mandelat dan turunannya telah dianggap sebagai zat penting karena digunakan secara luas untuk tujuan sintetik. (R)-asam mandelat digunakan untuk membuat antibiotik seperti sefalosporin dan penisilin semisintetik sedngkan (S)-asam mandelat digunakan untuk membuat obat antiinflamasi seperti deracoxib dan celecoxib. Kelebihan enansiomer tunggal adalah selektivitas yang lebih besar untuk target biologisnya, indeks terapeutik yang lebih baik, farmakokinetik yang lebih baik daripada campuran enansiomer, efek samping yang berkurang akibat aktivitas enansiomer yang tidak diinginkan. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh lipase yang bersifat sebagai biokatalis enansioselektif terhadap (R-S)-asam mandelat Enansioselektivitas lipase LK1, LK2, LK3 diukur dengan menggunakan HPLC kolom kiral dimana sebelumnya telah dilakukan optimasi terhadap fasa gerak heksan: isopropanol, laju alir 1 mL/menit, suhu kolom 30 o C dan penambahan TFA 4% dan juga validasi metode untuk memastikan bahwa pengujian yang akan dilakukan sudah sesuai dengan prasyarat pengujian. Hasil validasi metode menunjukkan persen perolehan kembali sebesar 100,06 untuk enansiomer R dan 100.10 untuk enansiomer S dengan % standar deviasi relatif masing-masing sebesar 0,482% dan 0,318 %. Hal ini menunjukkan bahwa metode analisa yang digunakan memberikan data yang mendekati nilai sebenarnya. Pemisahan campuran rasemat (R-S) asam Mandelat dengan kondisi ini menghasilkan dua puncak terpisah dengan puncak pertama yang muncul adalah puncak dari enansiomer (S)-asam Mandelat dan puncak kedua adalah puncak enansiomer (R)-asam Mandelat. Hal ini sejalan dengan studi komputasinya yang menunjukkan bahwa affinitas kompleks kolom dengan ligan R lebih stabil dibandingkan kompleks kolom dengan ligan S. Reaksi transesterifikasi antara vinil asetat dengan (R-S)-asam Mandelat yang dikatalisis oleh ketiga lipase diatas di inkubasi pada rentang suhu antara 45-65. Enansioselektifitas diikuti dengan menghitung enantiomeric excess (ee), yang menunjukkan angka banding enansiomer dominan terhadap campuran rasemat. Data pengamatan menunjukkan profil grafik antara suhu yang khas. Dari pola itu teramati ada 2 titik penting yang diperoleh yaitu suhu optimum dan suhu minimum. Pada suhu optimum, diperoleh nilai enansiomerik ekses yang paling maksimum. Suhu optimum pada LK1 terdapat pada suhu 45 o C dengan nilai enansiomerik ekses sebesar 10,2 %, LK2 terdapat pada suhu 65 o C dengan enansiomerik ekses sebesar 12,3% dan LK3 terdapat pada suhu 60 o C dengan enansiomerik ekses sebesar 13,3%. Sedangkan pada suhu minimum LK1 terdapat pada suhu 55 o C (enansiomerik ekses 3,4%), LK2 terdapat pada suhu 55 o C (enansiomerik ekses 3,2%) dan LK3 terdapat pada suhu 55 o C (enansiomerik ekses 0,6%). Pengukuran ini dilakukan dengan menggunakan HPLC kolom kiral dengan parameter hasil optimasi. Dari hasil pendekatan komputasi doking dengan Autodock Vina dan MD diperoleh bahwa enansiomer (R)-asam mandelat berinteraksi lebih kuat dibandingkan dengan enansiomer (S)-asam mandelat. Dapat dilihat dari nilai energi pengikatan enansiomer yang lebih rendah dibanding enansiomer S untuk lipase LK1, LK2 dan LK3. Pada kompleks enzim LK1-R, residu sisi aktif (Ser109, Asp255, His277) berikatan dengan ligan. Sedangkan pada kompleks enzim LK1-S residu sisi aktif tidak berikatan dengan ligan. Hal ini memungkinkan yang bereaksi dengan vinil asetat adalah enansiomer R. Kompleks LK2-R memiliki residu sisi aktif (Ser109, Asp255, His277) yang berikatan dengan ligan sedangkan kompleks enzim LK2-S residu sisi aktif tidak berikatan dengan ligan. Pada lipase LK3, kompleks enzim LK3-R memiliki residu sisi aktif (Ser109, Asp255, His277) yang berikatan dengan ligan sedangkan kompleks sedangkan kompleks enzim LK3-S ligan hanya berikatan dengan His277 dan Asp 255 Hal ini sejalan dengan hasil eksperimen yang menunjukkan bahwa enansiomer yang dikonversi menjadi produk dilihat dari pengurangan substrat enansiomer R-nya. Ikatan hidrogen pada enansiomer R pada Lk1, Lk2 dan Lk3 lebih banyak dibandingkan dengan enansiomer S. Pada suhu optimum, lipase isolat lokal LK1, LK2 dan LK3 memiliki pemisahan enansiomer lebih baik, hal ini dikarenakan dipengaruhi oleh residu spesifisitas masing-masing isolat. Pada LK1 dipengaruhi oleh residu spesifisitas Ala217 dan Leu220. Pada LK2 dipengaruhi oleh residu spesifisitas Leu205 dan Asn207. Sedangkan pada LK3 dipengaruhi oleh residu spesifisitas Leu205 dan Met210. Hasil eksperimen sejalan dengan studi komputasi. Sedangkan pada suhu minimum dapat dikatakan bahwa enzim tidak dapat membedakan antara enansiomer R dan S. Residu-residu spesifisitas yang terlibat pada reaksi di suhu optimum tidak ditemukan pada suhu minimum. Kata kunci: enansioselektif, kiral, lipase, (R,S)-asam mandelat, residu spesifisitas ABSTRACT ENANTIOSELECTIVITY OF ISOLATE LIPASE FROM THE METAGENOM APPROACH TO (R,S)-MANDELIC ACID IN TRANSESTERIFICATION REACTIONS LK1, LK2, and LK3 are lipase genes obtained from the metagenome of compost samples. The gene that encodes this lipase has been stored in GenBank with access numbers KP204883, KP204884, and KP204885 respectively. Lipase gene expression LK1, LK2, and LK3 in the pET30a(+) expression vector in Eschericia coli hosts induced by IPTG was carried out to obtain recombinant protein lipase. Mandelic acid enantiomers and their derivatives have been considered important substances due to their wide use for synthetic purposes. (R)-mandelic acid is used to make semi-synthetic antibiotics such as cephalosporins and penicillins. (S)-mandelic acid is used to make anti- inflammatory drugs such as deracoxib and celecoxib. The advantages of a single enantiomer are greater selectivity for its biological target, better therapeutic index, better pharmacokinetics than a mixture of enantiomers, and reduced side effects due to unwanted enantiomer activity. This study aims to obtain lipase which acts as an enantioselective biocatalyst for (RS-S)-mandelic acid The enantioselectivities of lipases LK1, LK2, and LK3 were measured using a chiral column HPLC where optimization of the hexane mobile phase had previously been carried out: isopropanol, flow rate of 1 mL/min, column temperature of 30oC and addition of 4% TFA and also validation of the method to ensure that the test to be carried out complies with the test requirements. The method validation results showed that the percent recovery was 100.06 for the R enantiomer and 100.10 for the S enantiomer with a % standard deviation relative to each of 0.482% and 0.318%. This shows that the analytical method used provides data that is close to the actual value. Separation of the racemic (R-S) Mandelat acid mixture under these conditions produced two separate peaks with the first peak appearing to be the enantiomer (S)-Mandelat acid peak and the second peak being the (R)-Mandelat acid enantiomer peak. This is in line with his computational studies which show that the affinity of column complexes with R ligands is more stable than column complexes with S ligands. The transesterification reaction between vinyl acetate and (R-S)-Mandelic acid catalyzed by the three lipases above was incubated at a temperature range of 45-65°C. Enantioselectivity is followed by calculating the enantiomeric excess (ee), which shows the ratio of the dominant enantiomer to the racemic mixture. Observational data showed graphical profiles between typical temperatures. From this pattern, it is observed that there are 2 important points obtained, namely the optimum temperature and minimum temperature. At the optimum temperature, the maximum excess enantiomeric value is obtained. The optimum temperature at LK1 is at 45 oC with an excess enantiomeric value of 10.2%, LK2 is at 65 oC with an excess enantiomeric of 12.3% and LK3 is present at 60 oC with an excess enantiomeric of 13.3%. Whereas at the minimum temperature, LK1 is present at 55 oC (excess 3.4% enantiomeric), LK2 is present at 55oC (3.2% enantiomeric excess) and LK3 is present at 55 oC (0.6% enantiomeric). This measurement was carried out using a chiral column HPLC with optimized parameter results. From the results of the computational docking approach with Autodock Vina and MD, it was found that the (R)-mandelic acid enantiomer interacted more strongly than the (S)-mandelic acid enantiomer. It can be seen from the enantiomer binding energy value which is lower than the S enantiomer for lipase LK1, LK2, and LK3. In the LK1-R enzyme complex, active site residues (Ser109, Asp255, His277) bind to ligands. In the LK1-S enzyme complex, the active site residue does not bind to the ligand. This allows the R enantiomer to react with vinyl acetate. The LK2-R complex has residues of active sites (Ser109, Asp255, His277) that bind to ligands, while the LK2- S enzyme complex of active site residues does not bind to ligands. In the LK3 lipase, the LK3-R enzyme complex has active site residues (Ser109, Asp255, His277) that bind to the ligand while the LK3-S ligand enzyme complex only binds to His277 and Asp 255. This is in line with experimental results which show that the enantiomer converted to product is seen from the reduction of the R enantiomer substrate. There are more hydrogen bonds in the R enantiomer in Lk1, Lk2, and Lk3 than in the S enantiomer. At the optimum temperature, lipase local isolates LK1, LK2, and LK3 had better enantiomeric separation, this was due to the influence of the specificity residue of each isolate. In LK1 it is affected by the specificity residues of Ala217 and Leu220. In LK2 it is affected by the specificity residues of Leu205 and Asn207. Meanwhile, LK3 is affected by the specificity residues of Leu205 and Met210. The experimental results are in line with computational studies. Whereas at the minimum temperature, it can be said that the enzyme cannot distinguish between the R and S enantiomers. The specificity residues involved in the reaction at the optimum temperature are not found at the minimum temperature. Keywords: enantioselective, chiral, lipase, (R,S)-mandelic acid, specificity residue.