15 Bab III Metode Penelitian III.1 Alat dan bahan Alat-alat yang digunakan untuk analisis laboratorium dalam penelitian ini di antaranya mikropipet 1000 μL, 200 μL, 100 μL, 20 μL, dan 10 μL; mesin Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies); BioShake iQ High Speed thermoshaker (Q Instruments); BioShake PCR Plate Adapter (Q Instruments); DynaMag 96-side Magnet (Thermo Fisher Scientific); Bio-Rad CFX Touch Thermal Cycler (Bio- Rad); Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific); vorteks; sentrifuga microplate; dan mesin NextSeq 550 (Illumina). Sementara itu, bahan-bahan yang dipakai dalam penelitian ini yaitu kit ekstraksi RNA QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN); kit Illumina Stranded Total RNA Prep, Ligation with Ribo Zero™ Plus (Illumina); tube microcentrifuge 2 mL bebas RNase; tip pipet barrier 1000 μL, 200 μL, 100 μL, 20 μL, dan 10 μL; plat PCR 96- well conical-base (Bio-Rad); Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter); Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter); kit Agilent DNA dan Agilent RNA (Agilent Technologies); tube konikal 15 mL dan 50 mL; etanol absolut; Microseal ‘B’ PCR plate sealing film (Bio-Rad); air bebas nuklease; Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent Technologies); dan medium transportasi virus berisi sampel usap oro- nasofaring. III.2 Metode Kerja III.2.1 Pemilihan Sampel dan Ekstraksi RNA Pasien pada penelitian ini direkrut dari sampel diagnosis yang diterima sebagai spesimen diagnosis harian di Laboratorium Kesehatan Jawa Barat selama periode September-Desember 2020. Metadata pasien seperti umur, jenis kelamin, status perawatan, dan gejala yang dimiliki saat pengambilan sampel diperoleh dari formulir pendaftaran. Sementara itu, beberapa formulir tidak menampilkan gejala sehingga diperoleh dari wawancara langsung pada pasien. Penelitian ini telah mendapatkan persetujuan etik oleh Komite Etik Penelitian, Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran, dengan nomor surat 320/UN6.KEP/EC/2021 (Lampiran 16 E). Persetujuan (consent) pasien secara tertulis atau verbal tidak dikumpulkan karena data pribadi (nama, tempat lahir, domisili, dll) serta urutan basa genomik pasien tidak dipakai dalam studi ini. Pasien dikelompokkan menjadi dua kategori yaitu pasien tanpa gejala dan pasien dengan gejala ringan. Pengelompokkan ini didasarkan pada pedoman dari National Institute of Health (NIH) Amerika Serikat mengenai spektrum klinis infeksi SARS- CoV-2 (NIH, 2021). Secara umum, pasien tanpa gejala merupakan individu yang tidak memiliki gejala klinis COVID-19 namun positif genom SARS-CoV-2 melalui hasil amplifikasi RT-qPCR. Sementara itu, pasien dengan gejala ringan menunjukkan setidaknya satu gejala umum COVID-19 (demam, batuk, sakit tenggorokan, lesu, sakit kepala, mual, muntah, serta penurunan indra perasa dan penciuman). Masing-masing digunakan dua sampel apusan nasofaring dari pasien tanpa gejala dan pasien dengan gejala ringan pada penelitian ini. Setiap sampel dites positif akan keberadaan genom SARS-CoV-2 dengan nilai Ct kurang dari 30,0. RNA dari tiap sampel diisolasi menggunakan kit ekstraksi RNA (QIAamp Viral RNA Mini Kit, QIAGEN, Jerman) dengan mengikuti protokol keluaran pabrik (Lampiran A). Kualitas dari RNA total dinilai dengan menggunakan RNA 6000 Pico Kit pada mesin Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Amerika Serikat). Konsentrasi RNA dihitung dengan menggunakan reagen Qubit® RNA High Sensitivity Assay pada mesin Qubit® 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Amerika Serikat). III.2.2 Sintesis cDNA, Persiapan Pustaka DNA, dan Pengurutan Basa DNA Sebanyak 1-10 ng RNA digunakan untuk konstruksi pustaka cDNA. Pustaka cDNA dihasilkan dengan menggunakan kit Illumina Stranded Total RNA Prep, Ligation with Ribo-Zero™ Plus (Illumina, Amerika Serikat) dengan mengikuti protokol keluaran pabrik (Lampiran B). Secara umum, kit ini mendegradasi rRNA sitoplasma dan mitokondria manusia, rRNA bakteri, serta transkripsi mRNA β- globin manusia. Setelah degradasi rRNA, RNA total difragmentasi dan didenaturasi 17 sebelum masuk ke tahap sintesis cDNA. Seluruh proses ini menghasilkan cDNA dengan panjang ~400 bp. Kemudian, satu nukelotida A-tail diligasi pada tiap ujung untai DNA yang baru disintesis dengan tujuan memasangkan adapter untuk barcode tiap sampel. Setelah itu, dilakukan amplifikasi PCR untuk memperbanyak pustaka cDNA. Produk PCR kemudian dipurifikasi dengan menggunakan sistem AMPure XP DNA. Konsentrasi pustaka DNA kemudian dikuantifikasi dengan reagen Qubit® DNA Broad Range Assay pada mesin Qubit® 2.0 Fluorometer (Life Technologies, Amerika Serikat). Pustaka DNA seluruh sampel kemudian disatukan dan diberi perlakuan denaturasi dan pengenceran sesuai protokol dari Illumina™ (Lampiran C). Pustaka PhiX ditambahkan ke campuran sebagai kontrol. Kemudian, pustaka cDNA ini diurutkan basanya dengan mesin Illumina NextSeq 550 sehingga dihasilkan read urutan basa DNA paired-end dengan panjang 101 bp. Empat replikat teknis dihasilkan untuk masing-masing sampel sehingga di akhir pengurutan didapatkan 16 set file fastq secara total. III.2.3 Analisis Genom SARS-CoV-2 Bacaan mentah berupa file .fastq yang didapatkan dari tiap-tiap sampel diunggah pada aplikasi DRAGEN RNA Pathogen Detection 3.5.15 pada laman akun BaseSpace Illumina (https://basespace.illumina.com/apps/12030018/DRAGEN- RNA-Pathogen-Detection). Aplikasi berbasis web ini melakukan pensejajaran bacaan pada target genom SARS-CoV-2 (NC_045512.2) dan virus lainnya dari panel virus sistem pernafasan Illumina (Y. Yang et al., 2018) serta Seattle Study Flu. Setelah didapatkan file .fasta berupa urutan genom utuh SARS-CoV-2, maka segera diunggah ke web https://gisaid.org bersama dengan metadata pasien. III.2.4 Analisis Koinfeksi Analisis metagenomik dilakukan menggunakan program berbasis web DRAGEN RNA Metagenomics Pipeline 3.5.10 di laman akun BaseSpace Illumina (https://basespace.illumina.com/apps/11610600/DRAGEN-Metagenomics- Pipeline?preferredversion). Aplikasi ini bekerja dengan menggunakan algoritma 18 Kraken Alignment untuk analisis metagenomik (Wood & Salzberg, 2014). Daftar identifier organisme dan referensi genom mengikuti sediaan default. III.2.5 Analisis Ekspresi Diferensial Bacaan mentah fastq yang didapatkan terlebih dahulu diproses untuk kontrol kualitas sebelum dilakukan pemetaan ke sekuen acuan. Proses ini dilakukan dengan menggunakan pengaya BBDuk pada program Geneious Prime v.2020.2. Proses kontrol kualitas ini menggunakan beberapa parameter sebagai berikut: pemotongan right-end adapter Truseq, pengecualian read dengan skor di bawah Q30, dan pengecualian read dengan panjang kurang dari 30 bp. FASTQC digunakan untuk melakukan pengecekan kualitas bacaan pasca pemrosesan. Kemudian, read yang telah dibersihkan ini dipetakan ke sekuen acuan genom manusia hg19 yang telah dianotasi dengan keterangan gen. Pemetaan dilakukan dengan pengaya Geneious RNA mapper menggunakan pengaturan bawaan sebagai berikut: minimal overlap 25 basa, maksimum mismatch sepanjang 20% dari total bacaan, serta mengizinkan gap untuk intron. Level ekspresi gen dihitung dengan mengambil nilai raw read counts. Nilai ini dihitung dengan menggunakan menu Calculate Expression Level pada hasil pemetaan. Apabila suatu read terpetakan ke dua wilayah dalam genom, maka hanya dipilih satu yang paling sesuai untuk menghindari bias pemetaan. Data ini kemudian diekspor untuk melakukan analisis ekspresi diferensial (DE). Analisis DE dilakukan dengan menggunakan package DESeq2 pada R (Love et al., 2014). Script analisis DESeq2 secara lengkap dilampirkan pada Lampiran D. Kontrol negatif didapatkan dari set data penelitian sebelumnya di mana dilakukan perhitungan matriks raw read counts dari sampel usap nasofaring individu tidak terinfeksi SARS-CoV-2 (Lieberman et al., 2020). Matriks ini merupakan matriks numerik bilangan bulat dengan column names dan row names berturut-turut merupakan kode sampel dan simbol gen. Data dibagi dalam tiga kelompok: asymptomatic, symptomatic, dan control. Matriks ini kemudian dinormalisasi dengan menggunakan perintah counts(data, normalized = TRUE). Sebelum dilakukan analisis ekspresi gen diferensial dengan perintah DESeq(), terlebih dahulu dilakukan analisis kontrol kualitas. Visualisasi principal component 19 analysis (PCA) digunakan untuk melihat jarak antarsampel berdasarkan variabel gen yang sangat banyak. Untuk melakukannya, data ditransformasi untuk visualisasi dengan perintah rlog(data, blind=TRUE). Hasil transformasi data ini kemudian digunakan untuk visualisasi plot PCA menggunakan perintah plotPCA(). Kemudian, dilakukan analisis pengklasteran hirarki untuk melihat similaritas antarsampel. Komputasi Pearson’s correlation digunakan untuk melihat kedekatan antarsampel. Komputasi ini menggunakan perintah cor() pada matriks data hasil luaran perintah rlog() sebelumnya. Selanjutnya, luaran cor() divisualisasi menjadi heatmap dengan package pheatmap (Kolde, 2019).Gen-gen yang secara signifikan terekspresikan secara diferensial dipilih berdasarkan dua parameter yaitu memiliki nilai p hitung < 0,01 dan nilai |log2 fold change| > 2. III.2.6 Analisis Ontologi Gen Gen yang terekspresikan secara diferensial kemudian digunakan untuk analisis ontologi gen (GO). Analisis ontologi gen dilakukan untuk menentukan istilah ontologi yang diperkaya (enriched terms) serta gen-gen yang terlibat dalam proses tersebut. Analisis dilakukan dengan menggunakan package R clusterProfiler 4.0 (http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html) (Guangchuang et al., 2012). Package ini menentukan proses biologis termodulasi berdasarkan distribusi hipergeometrik nonsentral Wallenius. Masukan yang dibutuhkan untuk analisis ini adalah set gen yang mengalami pengayaan sesuai analisis DE dan gen background yang merupakan set seluruh gen pada analisis DE. Selanjutnya, package ini akan menghitung rasio gen, adjusted p-value, serta jumlah gen yang mengalami perubahan level ekspresi dalam satu istilah ontologi..