EKSPRESI HETEROLOG DAN KARAKTERISASI LIPASE TERMOSTABIL DARI BAKTERI ISOLAT SUMBER AIR PANAS MANUK DAN KOMPOS DI Pichia pastoris DISERTASI Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dari Institut Teknologi Bandung Oleh DIMAS FRANANTA S NIM: 30516301 (Program Studi Doktor Kimia) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Juli 2023 HETEROLOGOUS EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF THERMOSTABLE LIPASE FROM BACTERIAS OF MANUK HOT SPRING AND COMPOST ISOLATE IN Pichia pastoris DISSERTATION In partial fulfilment of the requirements for the Degree of Doctor of Philosophy from Institut Teknologi Bandung By DIMAS FRANANTA S Student ID: 30516301 (Doctoral Program in Chemistry) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG July 2023 ABSTRAK EKSPRESI HETEROLOG DAN KARAKTERISASI LIPASE TERMOSTABIL DARI BAKTERI ISOLAT SUMBER AIR PANAS MANUK DAN KOMPOS DI Pichia pastoris Oleh Dimas Frananta S NIM: 30516301 (Program Studi Doktor Kimia) Penemuan mengenai enzim baru yang aktif termasuk lipase termostabil yang dapat bekerja secara optimal dan tidak kehilangan aktivitasnya pada keadaan ekstrem merupakan prioritas tertinggi untuk berbagai aplikasi dalam industri. Penggunaan lipase termostabil memberikan banyak keuntungan karena stabilitas, aktivitas dan daya tahan terhadap kondisi ekstrem. Salah satu cara untuk memproduksi lipase termostabil adalah dengan melakukan ekspresi heterolog pada sistem Escherichia coli, namun sering mengalami permasalahan yang kompleks sehingga diperlukan kajian alternatif dengan cara mencari sistem inang baru yang lebih baik. Dalam beberapa tahun terakhir, ekspresi pada sistem eukariotik dari lipase termostabil telah dilakukan pada ragi Pichia pastoris karena memiliki banyak keunggulan dibanding dengan sistem ekspresi E. coli seperti memiliki modifikasi genetik yang mudah, produksi protein asing secara intraseluler dan ekstraseluler, modifikasi pasca translasi, dan protein yang dihasilkan memiliki stabilitas yang tinggi. Penelitian yang berfokus pada efisiensi dan keefektifan ekspresi heterolog lipase termostabil pada P. pastoris dan studi karakterisasinya masih tergolong sedikit dan belum banyak dilaporkan. Penelitian ini diharapkan memberikan keterbaruan dalam meningkatkan aktivitas lipase termostabil dan mendapatkan karakter khasnya untuk keperluan aplikasi industri. Pada penelitian ini telah dilakukan subkloning, ekspresi heterolog, pemurnian dan karakterisasi lipase termostabil dari bakteri isolat Indonesia. Dua lipase termostabil dipilih yaitu Itb1.1 dan Lk3 untuk kajian ini. Gen pengode lipase ITB1.1 dan LK3 sebelumnya berada pada plasmid ekspresi E. coli pET30a(+) yang dinamakan pET30a(+)-ITB1.1 dan pET30a(+)-LK3. Kemudian dilakukan rekonstruksi plasmid kloning pJET1.2 dengan mengamplifikasi gen pengode ITB1.1 dan LK3 dengan sepasang primer spesifik masing-masing yang memiliki sisi pengenalan restriksi EcoRI dan XbaI. Plasmid rekombinan baru dinamakan pJET1.2-ITB1.1 dan pJET1.2-LK3. Selanjutnya dilakukan subkloning gen pengode ITB1.1 dan LK3 ke plasmid ekspresi ragi P. pastoris pPICZαA. Plasmid ekspresi rekombinan baru dinamakan pPICZαA-ITB1.1 dan pPICZαA-LK3. Kemudian plasmid ini ditransformasikan ke sel E. coli TOP10F’ untuk perbanyakan plasmid dan dikonfirmasi dengan metode penapisan ukuran, analisis restriksi tunggal dan ganda, koloni PCR dan sequencing. Hasil menunjukkan bahwa gen pengode lipase telah in frame dengan sinyal sekresi faktor α dan tag polihistidin pada plasmid ekspresi ragi. Plasmid ekspresi kemudian ditransformasikan ke sel ragi P. pastoris GS115. Transformasi dilakukan dengan metode elektroporasi dan hasil transformasi ditumbuhkan pada media YPD yang mengandung antibiotik zeocin 100 μg/mL serta diseleksi koloni yang membawa gen multikopi dengan meningkatkan konsentrasi zeocin 2000 μg/mL. Transforman kemudian ditumbuhkan untuk memproduksi lipase Itb1.1 dan Lk3 dengan induksi metanol 0,5% (v/v) per 24 jam selama 5 hari. Supernatan sebagai ekstrak kasar lipase Itb1.1 dan Lk3 dianalisis aktivitas hidrolisis dan kadar protein dengan metode kolorimetri. Kondisi pengujian lipase Itb1.1 menggunakan substrat pNP palmitat pada suhu 70 ° C dan pH 8 sedangkan lipase Lk3 menggunakan substrat pNP laurat pada suhu 50 ° C dan pH 8. Hasil menunjukkan bahwa aktivitas spesifik ekstrak kasar lipase termostabil Itb1.1 dan Lk3 masing-masing sebesar 2,918 U/mg dan 0,3301 U/mg. Sebagai perbandingan, E. coli digunakan untuk mengekspresikan lipase termostabil dengan aktivitas spesifik ekstrak kasar Itb1.1 dan Lk3 masing-masing sebesar 0,5121 U/mg dan 0,0251 U/mg. Produktivitas lipase (yield) Itb1.1 dan Lk3 (8,0197 U/g/hari dan 5,1875 U/g/hari) yang diekspresikan pada P. pastoris menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang diekspresikan pada E. coli (2,7939 U/g/hari dan 0,3423 U/g/hari). Optimasi ekspresi lipase Itb1.1 dan Lk3 telah dilakukan dengan variasi konsentrasi penginduksi dimana lipase Itb1.1 diinduksi dengan konsentrasi metanol 2% (v/v) selama 6 hari dan lipase Lk3 diinduksi dengan konsentrasi metanol 1% (v/v) selama 5 hari. Berat molekul kedua lipase diduga masing-masing sebesar ~50 kDa dan ~32 kDa. Ekstrak kasar lipase Itb1.1 dan Lk3 kemudian dimurnikan dengan kromatografi afinitas Ni-NTA. Lipase Itb1.1 dan Lk3 murni yang diekspresikan pada P. pastoris memiliki aktivitas spesifik masing-masing sebesar 7,6836 dan 4,85 U/mg dengan peningkatan 6,4 dan 13,7 kali dibanding dengan yang diekspresikan pada E. coli. Lipase Itb1.1 dan Lk3 telah berhasil dikarakterisasi dan memiliki aktivitas hidrolisis dan transesterifikasi. Preferensi substrat untuk lipase Itb1.1 dan Lk3 adalah pNP dekanoat (C10) dan pNP laurat (C12) dengan suhu optimum masing-masing pada 85 ° C dan 60 ° C serta pH optimum kedua lipase adalah 9,5 dan 8. Lipase Itb1.1 memiliki termostabilitas yang lebih baik dan lebih tahan pada beberapa pelarut organik dibandingkan lipase Lk3. Lipase Itb1.1 juga memiliki toleransi yang cukup baik dengan penambahan deterjen daripada lipase Lk3. Adanya penambahan ion logam Fe 2+ , Mg 2+ , Ni 2+ dan Ca 2+ dapat meningkatkan aktivitas lipase Itb1.1 dan ion logam Zn 2+ , Ni 2+ dan Fe 3+ dapat meningkatkan aktivitas lipase Lk3. Adanya ion Zn 2+ menurunkan aktivitas lipase Itb1.1 yang bertentangan dengan lipase dari keluarga I.5 yang memiliki karakter khas sebagai enzim yang bergantung pada Zn 2+ sehingga lipase Itb1.1 diduga merupakan lipase baru dalam keluarga I.5. Demikian juga, lipase Lk3 diduga termasuk dalam keluarga I.1 yang baru dimana secara umum dengan penambahan ion Ca 2+ dapat meningkatkan aktivitas lipase namun justru menurunkan aktivitas lipase Lk3. Kedua lipase ini stabil pada pelarut non polar dengan substrat metil miristat (C14:0) untuk lipase Itb1.1 dan metil linoleat (C18:2) untuk lipase Lk3 pada reaksi transesterifikasi. Adanya perubahan preferensi substrat dengan rantai karbon yang lebih panjang pada reaksi transesterifikasi dibandingkan pada reaksi hidrolisis diduga karena luas dan volum area kantong katalitik mengalami peningkatan selama reaksi transesterifikasi. Analisis biokomputasi menggunakan penambatan molekuler dan simulasi dinamika molekul serta bioinformatika berbasis peladen web telah dilakukan untuk memprediksi, mengonfirmasi dan mendukung hasil- hasil eksperimen yang telah diperoleh. Dari hasil-hasil tersebut maka lipase termostabil Itb1.1 dan Lk3 memiliki potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai biokatalis industri. Kata kunci: subkloning, ekspresi heterolog, pemurnian, karakterisasi, lipase Itb1.1, lipase Lk3, E. coli, P. pastoris ABSTRACT HETEROLOGOUS EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF THERMOSTABLE LIPASE FROM BACTERIAS OF MANUK HOT SPRING AND COMPOST ISOLATE IN Pichia pastoris By Dimas Frananta S NIM: 30516301 (Doctoral Program in Chemistry) Discovery of new active enzymes including thermostable lipases that can work optimally and not lose their activity in extreme conditions is the highest priority of various applications in industry. The use of thermostable lipase provides many significant advantages due to its stability, activity and resistance to extreme conditions. A technique to produce thermostable lipase is by heterologous expression in Escherichia coli system but it often undergoes the complex problem therefore alternative study is needed to find a new and better host system. In recent years, expression of thermostable lipase in eukaryotic system has been carried out on Pichia pastoris yeast because it has many advantages over E. coli expression systems such as having easy genetic modifications, intracellular and extracellular foreign protein productions, post-translational modification, and proteins have high stability. A study focused on the efficiency and effectiveness of heterologous expression of thermostable lipase in P. pastoris and its characterization studies is still relatively infrequent and has not been widely reported. This research is expected to provide novelty in improving thermostable lipase activity and acquiring its distinctive characteristics for industrial application purposes. In this research, subcloning, heterologous expression, purification and characterization of thermostable lipase from Indonesian bacterial isolates were carried out. Two thermostable lipases were selected namely Itb1.1 and Lk3 for this study. The gene encoding thermostable lipase ITB1.1 and LK3 were previously present in E. coli expression plasmid pET30a(+) called pET30a(+)-ITB1.1 and pET30a(+)-LK3. Then the reconstruction of cloning plasmid pJET1.2 was performed first by amplifying the gene encoding thermostable lipase ITB1.1 and LK3 with a pair of specific primers having EcoRI and XbaI restriction recognition sides respectively. The new recombinant plasmids were named pJET1.2-ITB1.1 and pJET1.2-LK3. Subsequently, the gene encoding ITB1.1 and LK3 were subcloned into the P. pastoris yeast expression plasmid pPICZαA. The new recombinant expression plasmids were named pPICZαA-ITB1.1 and pPICZαA-LK3. Then these plasmids were transformed into E. coli TOP10F' cells for plasmid propagation and confirmed by size screening method, single and multiple restriction analysis, PCR colony and sequencing. The results showed that the gene encoding lipase was in frame with α-factor secretion signal and polyhistidine tag on the yeast expression plasmid. The expression plasmid was then transformed into P. pastoris GS115 yeast cells. Transformation was carried out by electroporation method and the transformation results were grown on YPD media containing zeocin 100 μg/mL and colonies carrying multicopy genes were selected by increasing zeocin concentration to 2000 μg/mL. Transformants were then grown to produce Itb1.1 and Lk3 lipases with 0.5% (v/v) methanol induction per 24 hours for 5 days. Supernatants as crude extract of lipase Itb1.1 and Lk3 were analyzed for hydrolysis activity and protein content by colorimetric method. The reaction condition for lipase Itb1.1 was at 70 ° C and pH 8 with pNP palmitate as substrate while reaction for lipase Lk3 was carried out at 50 ° C and pH 8 with pNP laurate as substrate. The results showed that the specific activity of thermostable lipase Itb1.1 and Lk3 were 2.918 U/mg and 0.3301 U/mg respectively. As a comparison, E. coli was used to express thermostable lipase with specific activities of crude extracts Itb1.1 and Lk3 at 0.5121 U/mg and 0.0251 U/mg respectively. The lipase productivity (yield) of Itb1.1 and Lk3 (8.0197 U/g/day and 5.1875 U/g/day) expressed in P. pastoris showed higher results compared to those expressed in E. coli (2.7939 U/g/day and 0.3423 U/g/day). Optimization of Itb1.1 and Lk3 lipase expression has been carried out by varying the inducer concentration where Itb1.1 lipase was induced with 2% (v/v) methanol for 6 days and Lk3 lipase was induced with 1% (v/v) methanol for 5 days. The molecular weights of the two lipases were estimated to be ~50 kDa and ~32 kDa, respectively. Crude extracts of Itb1.1 and Lk3 lipases were then purified by Ni-NTA affinity chromatography. The purified Itb1.1 and Lk3 lipases expressed in P. pastoris had specific activities of 7.6836 and 4.85 U/mg respectively, with 6.4 and 13.7-fold increase compared with those expressed in E. coli. The expression levels of Itb1.1 (8.63%) and Lk3 (12.28%) lipases expressed in P. pastoris were higher than those of Itb1.1 (7.92%) and Lk3 (9.10%) lipases expressed in E. coli. Lipases Itb1.1 and Lk3 have been successfully characterized and both lipases showed hydrolysis and transesterification activities. The substrate preferences for lipase Itb1.1 and Lk3 were pNP decanoate (C10) and pNP laurate (C12) with optimum temperatures at 85 ° C and 60 ° C respectively and the optimum pH of both lipases were 9.5 and 8. Lipase Itb1.1 has better thermostability and is more resistant to several organic solvents than lipase Lk3. Lipase Itb1.1 also has a good tolerance with the addition of detergents than lipase Lk3. The addition of metal ions Fe 2+ , Mg 2+ , Ni 2+ and Ca 2+ could increase the activity of Itb1.1 lipase while metal ions Zn 2+ , Ni 2+ and Fe 3+ could increase the activity of Lk3 lipase. The presence of Zn 2+ ion decreases the activity of Itb1.1 lipase which is contrary to lipases from family I.5 which have distinctive characteristics as Zn 2+ -dependent enzymes so that Itb1.1 lipase is thought to be a new lipase in family I.5. Likewise, Lk3 lipase is thought to belong to the new family I.1 where in general the addition of Ca 2+ ion can increase lipase activity but actually it decreases the activity of Lk3 lipase. Both lipases were stable in non-polar solvents with substrates preferences for transesterification reaction namely methyl myristate (C14:0) for Itb1.1 lipase and methyl linoleate (C18:2) for Lk3 lipase.