61 Bab IV Pembahasan Pada penelitian ini telah dilakukan kajian fitokimia terhadap sampel kulit batang, biji, dan daun dari D. densiflorum serta sampel buah dari S. mahogany. Kajian fitokimia dua spesies tersebut melibatkan tiga tahapan proses isolasi, yaitu ekstraksi, fraksinasi, dan pemurnian, menggunakan berbagai teknik kromatografi. Berdasarkan metodologi tersebut, sebelas senyawa murni telah berhasil diisolasi dari kedua spesies tersebut. Struktur molekul senyawa murni tersebut ditetapkan berdasarkan hasil analisis data spektroskopi, yang meliputi data IR, MS, NMR 1-D dan -2D, serta spektrum massa. Senyawa-senyawa tersebut yaitu dua senyawa seskuiterpenoid 8-hidroksikalamenen (1) dan 4-isopropil-1,5-dimetil-1,2,3,4- tetrahidronaftalen-6-ol (2), empat senyawa triterpenoid tetrasiklik yaitu asam densiflorinat A - C (3-5) dan afagranin G (6) serta enam senyawa limonoid yaitu proseranolida (7), swietenolida (8), 6-O-asetilswietenolida (9), 3,6-O- asetilswietenolida (10), dan swietenin (11). Di antara sebelas senyawa yang berhasil diisolasi termasuk di antaranya empat senyawa baru yang terdiri atas satu senyawa turunan seskuiterpenoid yaitu senyawa 2 dan tiga senyawa turunan triterpenoid tetrasiklik yaitu senyawa 3, 4, dan 5. Gambar IV. 1 Senyawa-senyawa turunan terpenoid hasil isolasi dari D.densiflorum dan S.-mahogany 62 Gambar IV.1 Senyawa-senyawa turunan terpenoid hasil isolasi dari D. densiflorum dan S. mahogany (Lanjutan) Pada bagian ini akan dibahas mengenai penentuan struktur molekul dari masing- masing senyawa hasil isolasi, saran biogenesis dari senyawa hasil isolasi, pengujian aktivitas biologi dari senyawa hasil isolasi yang berkaitan dengan analisis hubungan struktur dan aktivitas. Bioaktivitas senyawa-senyawa murni ditentukan meliputi sifat antibakteri terhadap tujuh bakteri patogen, antijamur terhadap dua jamur pelapuk kayu yaitu Fomitopsis palustris (Brown-rot) dan Trametes versicolor (White-rot), serta antifedan terhadap rayap C. formasanus Shiraki. Pengujian antibakteri dilakukan dengan menggunakan metoda mikrodilusi (CSLI, 2012) menggunakan sepuluh bakteri patogen yang berasal dari isolat klinik lokal koleksi Politeknik Kesehatan, Cimahi, Jawa Barat dan beberapa bakteri ATCC koleksi Fakultas Kedokteran, Universitas Padjajaran. Bakteri-bakteri tersebut terdiri atas 63 dua bakteri gram positif, yaitu Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus (ATCC 29737), serta delapan bakteri gram negatif, yaitu Escherichia coli, Klebsiella pneumonie (ATCC 13733), Proteus mirabilis (ATCC 21100), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella parathypii, Salmonella thypii (ATCC 14028), Shigella dysentriae, Vibrio Cholereae. Sementara itu pengujian antijamur dilakukan dengan metode difusi cakram sesuai dengan Manual of Clinical Microbiology (Muray, dkk., 1995) menggunakan dua jamur pelapuk kayu yaitu jamur brown-rot [Fomitopsis palustris (Berk. Et Curt) Gilbn. & Ryv. (FFPRI 0507)] dan jamur white-rot [Trametes versicolor (L.:Fr.) Pilat. (FFPRI 1030)]. Kedua jamur uji diambil dari koleksi jamur yang berada di Research Institute for Sustainable Humanosphere (RISH), Kyoto University. Sedangkan pengujian antifedan dilakukan dengan metode no-choice test mengikuti Japan Wood Preserving Association (JWPA) standard JWPS-TW-P.1 (JWPA, 2001) menggunakan rayap C. formasanus Shiraki yang diambil dari koleksi rayap di laboratorium koloni rayap yang berada di Research Institute for Sustainable Humanosphere (RISH), Kyoto University. IV.1 Penentuan Struktur Penentuan struktur senyawa hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan data spektroskopi IR, 1D-NMR dan 2D-NMR serta data lain seperti nilai putaran optik dan titik leleh untuk senyawa yang berbentuk padatan. Data masing-masing senyawa hasil senyawa isolasi yang telah didapatkan selanjutnya dibandingkan dengan data senyawa literatur yang memiliki kemiripan dengan data dari senyawa hasil isolasi. IV.1.1 8-Hidroksikalamenen (1) Senyawa 1 diperoleh berupa gum berwarna kuning gelap, >�. ½ 69 +35 (c 1,0; CH 3OH). Spektrum IR (infra red) menunjukkan adanya serapan-serapan infra merah gugus fenol (υ max cm -1 : 3347, 1457, 1160, 896, 756). Data spektrum 13 C-NMR senyawa 1 memperlihatkan adanya 15 sinyal yang terbagi kepada empat sinyal C-metil (δ C 22,3, 21,4, 21,3 dan 19,7 ppm), dua sinyal C-metilen (δ C 27,3 dan 19,2 ppm), tiga sinyal C-metin alifatik (δ C 26,7, 43,4, dan 33,5 ppm) dan enam 64 sinyal C-sp 2 alkena (δ C 100-150 ppm) yang menyarankan senyawa ini merupakan turunan seskuiterpen dengan satu cincin aromatik. Adanya cincin aromatik pada struktur senyawa 1 adalah khas untuk seskuiterpen golongan kalamenen (kadinan) yang ditunjukkan pada (1a). Struktur dasar kalamenen (kadinan) juga diperkuat dengan adanya tiga sinyal proton -CH 3 doblet (J = 6,8 dan 6,9) (δ H 1,25, 1,03 dan 0,87) dan satu sinyal proton -CH 3 singlet (δH 2,27). 1a Adanya satu sinyal karbon (δ C 153,3 ppm) dan satu sinyal proton melebar (δ H 4,96 (s) ppm) menunjukkan adanya gugus hidroksil. Penentuan posisi gugus hidroksil pada cincin aromatik dilakukan dengan melihat adanya dua sinyal proton singlet melebar (δ H 6,64 (H-5) dan 6,47 (H-7) ppm) menyarankan posisi gugus hidroksil kemungkinan berada pada C-6 atau C-8. Kepastian posisi gugus hidroksil dilihat menggunakan data spektrum HMBC. Dari data tersebut terlihat adanya korelasi dari sinyal proton metil singlet (δ H 2,27 ppm) dengan sinyal karbon kwarterner aromatik (δ C 135,8, C-6) dan dua sinyal karbon metin aromatik (δC 113,4, H-7 dan 123,8, H- 5) yang menyarankan bahwa posisi metil singlet berada pada C-6 dan gugus hidroksil berada pada C-8. Posisi gugus hidroksil juga diperkuat dengan adanya korelasi antara sinyal proton -OH fenol (δ H 4,96) dan -CH3 (δH 1,25, H-14) dengan sinyal karbon kwarterner aromatik pada δ C 126,9 (C-9) yang berarti kedua gugus tersebut berdekatan. Hal ini menegaskan bahwa gugus aromatik memiliki tetrasubstitusi. Penentuan posisi gugus isopropil juga dilakukan dengan melihat adanya korelasi antara sinyal dua proton metil doblet yang memiliki korelasi yang sama ke C-4 dan C-11 (Gambar IV.2). Gambar IV. 2 Korelasi HMBC ( 1 H œ 13 C) penting pada senyawa 1 65 Penentuan stereokimia absolut pada C-1 dan C-4 dilakukan dengan membandingkan nilai putaran optik senyawa 1 dengan nilai putaran optik 8-hidroksikalamenen yang telah dilaporkan oleh Mulholland dkk (>�. ½ 69 + 36,5, (c 0,05; CH 3OH)). Berdasarkan kedekatan dua nilai putaran optik tersebut maka dapat disarankan bahwa konfigurasi absolut dari karbon kiral pada senyawa 1 yaitu 1S dan 4R. Perbandingan data NMR antara senyawa 1 dengan data NMR 8-hidroksikalamenen yang telah dilaporkan oleh Mulholland dkk (1997) ditunjukkan pada Tabel IV.1. Tabel IV. 1 Perbandingan data NMR 8-hidroksikalamenen (1) hasil isolasi dengan literatur dalam pelarut CDCl 3 No 1 1* δH (mult., J dlm Hz) δC δH (mult., J dlm Hz) δC 1 3,12 (sext, J = 6,5) 26,7 3,07 (m) 26,8 2a 2,02 (m) 27,3 1,81 (m) 27,3 2b 1,55 (m) 1,51 (m) 3 1,82 (m) 19,2 1,78 (m) 19,3 4 2,51 (td, J = 6,0; 2,5) 43,4 2,46 (m) 43,3 5 6,64 (br s) 123,8 6,57 (m) 123,1 6 ‒ 135,8 ‒ 135,1 7 6,47 (br s) 113,4 6,39 (bs) 113,6 8 ‒ 153,3 ‒ 153,1 9 ‒ 126,9 ‒ 126,4 10 ‒ 141,8 ‒ 141,3 11 2,05 (m) 33,5 1,98 (m) 33,4 12 1,03 (d, J = 6,8) 19,7 0,81 (d, J = 7,0) 19,8 13 0,87 (d, J = 6,8) 21,4 0,97 (d, J = 7,0) 21,2 14 1,25 (d, J = 6,9) 22,3 1,20 (d, J = 7,0) 22,3 15 2,27 (s) 21,3 2,21 (s) 21,4 OH 4,96 (s) ‒ 5,30 bs ‒ *Mulholland dkk (1997) IV.1.2 4-Isopropil-1,5-dimetil-1,2,3,4 tetrahidronaftalen-6-ol (2) Senyawa 4-isopropil-1,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-6-ol (2) diisolasi berupa minyak berwarna kuning gelap, >�. ½ 69 + 34 (c 1,0; CH 3OH), dan memiliki rumus molekul C 15H22O (DBE = 5) sesuai dengan pengukuran HRESITOFMS ([M+H] + m/z 219,1758, perhitungan m/z 219,1749). Berdasarkan data spektrum 13 C-NMR senyawa ini (Tabel IV.2), bersama-sama dengan spektrum HSQC, 66 memperlihatkan adanya 15 sinyal yang terbagi kepada empat sinyal C-metil, dua sinyal C-metilen, tiga sinyal C-metin alifatik, dan enam sinyal C-sp 2 termasuk diantaranya sinyal C-oksiaril (δ C 151,8). Sinyal-sinyal karbon tersebut mirip dengan data 13 C-NMR yang diperlihatkan oleh senyawa 1. Sama halnya dengan senyawa 1, spektrum 1 H-NMR senyawa 2 memperlihatkan empat sinyal proton metil, tiga di antaranya berupa doblet (δ H 1,26, 0,90 dan 0,82) dan satu sinyal adalah singlet (δ H 2,21).