43 Bab III Metoda dan Hasil Penelitian III.1 Umum Isolasi metabolit sekunder dari tumbuhan D. densiflorum dan S. mahogany dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut aseton. Ekstrak aseton yang didapatkan dari masing-masing sampel selanjutnya difraksinasi dengan teknik kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan pelarut yang ditingkatkan kepolarannya. Fraksi-fraksi yang diperoleh selanjutnya dipisahkan dan dimurnikan menggunakan berbagai teknik, yaitu kromatografi radial (KR) dan kromatografi kolom gravitasi (KKG). Pengujian kemurnian senyawa hasil isolasi ditentukan berdasarkan analisis kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan tiga sistem eluen yang berbeda. Pelarut yang digunakan untuk isolasi merupakan pelarut teknis yang telah didestilasi dan pelarut berkualitas pro analisa (p.a). Kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan silika gel 60 GF 254 (Merck), kromatografi radial menggunakan silika gel 60 PF 254 (Merck), dan analisis kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan pelat aluminium berlapis silika gel Merck 60 GF 254 dengan ketebalan 0,25 mm. Larutan 1,5% serium sulfat dalam asam sulfat 2N digunakan sebagai penampak noda pada analisis KLT. Penetapan struktur molekul dilakukan berdasarkan data-data spektroskopi yang meliputi spektroskopi inframerah (IR), resonansi magnet inti (NMR) 1D ( 1 H NMR dan 13 C NMR) dan 2D (COSY, HMQC, dan HMBC) dan MS (spektrometri massa). Spektrum inframerah (IR) ditentukan dengan spektrofotometer IR (Bruker Alpha). Selanjutnya, spektrum 1 H-NMR dan 13 C-NMR ditentukan dengan spektrometer JEOL ECA500 yang beroperasi pada 500 MHz ( 1 H) dan 125 MHz ( 13 C) menggunakan pelarut aseton-d 6 dan CDCl3. Spektrum massa ditentukan dengan Bruker HCT ESI-IT (Electro Spray Ionization-Ion Trap) dan Waters LCT XE ESI- TOF (Electro Spray Ionization-Time of Flight) yang ada di BSC-A, FMIPA, ITB. Putaran optik ditentukan dengan polarimeter Autopol IV Rudolph Research Analytical yang ada di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, FMIPA, ITB. 44 Penentuan bioaktivitas antibakteri senyawa hasil isolasi terhadap bakteri patogen dilakukan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam (KOBA) ITB menggunakan metode mikrodilusi mengacu pada standar CLSI (Clinical and Laboratory Standars Institute) M7-A9 (CLSI, 2012). Uji ketahanan terhadap jamur dilakukan dengan melihat zona hambat terhadap jamur pelapuk kayu Fomitopsis palustris TYP0507 (brown-rot) dan Trametes versicolor (white-rot), sedangkan uji antifedan dilakukan dengan metode no-choice terhadap rayap C. phormasanus Shiraki. Kedua uji jamur pelapuk kayu dan uji antifedan dilakukan di Research Institute for Sustainable Humanosphere (RISH), Kyoto University, Jepang. III.2 Bahan Tumbuhan Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian kulit batang, biji, dan daun dari Dysoxylum densiflorum serta bagian buah dari Swietenia mahogany. Kedua tumbuhan merupakan tumbuhan Meliaceae yang tumbuh di Indonesia. Sampel kulit batang dan biji D. densiflorum diperoleh dari Kebun Raya Ekaristi, Bali, sedangkan sampel daun tumbuhan ini dikumpulkan dari Kebun Raya Bogor. Sampel buah S. mahogany diperoleh dari daerah Bandung, Jawa Barat. Spesimen tumbuhan diidentifikasi dan disimpan di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong. Seluruh bagian tumbuhan yang telah dikumpulkan selanjutnya dibersihkan dan dikeringkan di udara terbuka kemudian digiling menjadi serbuk. III.3 Isolasi Metabolit Sekunder dari batang, biji, dan daun D. densiflorum Serbuk kulit batang, biji, dan daun D. densiflorum masing- masing sebanyak 1 kg; 0,5 kg, dan 2 kg dimaserasi menggunakan pelarut aseton selama 3 kali (@ 24 jam) pada temperatur kamar. Filtrat hasil maserasi dipisahkan dari residunya dengan menggunakan corong Büchner. Filtrat dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotary evaporator sehingga dihasilkan ekstrak aseton kulit batang, biji, dan daun masing-masing sebanyak 65, 32, dan 90 gram. Ekstrak aseton dari masing-masing bagian tumbuhan selanjutnya dipisahkan dan dimurnikan hingga diperoleh senyawa murni. 45 III.3.1 Isolasi Metabolit Sekunder dari kulit batang D. densiflorum Sebanyak 20 gram ekstrak aseton kulit batang difraksinasi menggunakan teknik kromatografi, yaitu kromatografi cair vakum (KCV) dengan komposisi eluen n-heksana dan etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 3:7; 2:8) sehingga diperoleh sembilan fraksi yaitu fraksi A (50 mg), fraksi B (1,34 g), fraksi C (0,13 g), fraksi D (0,19 mg), fraksi E (0,15 mg), fraksi F (0,25 g), fraksi G (1,2 g), fraksi H (0,63 g) dan fraksi I (1,5 g). Pemisahan fraksi C (130 mg) dengan KR menggunakan eluen n-heksana : EtOAc menghasilkan tiga fraksi, yaitu fraksi C.1-C.3. Fraksi C.2 merupakan senyawa murni yang diidentifikasi sebagai senyawa 8-hidroksikalamenen (1) sebanyak 32 mg. Dengan komposisi eluen yang sama, masing-masing fraksi D sebanyak 189 dan fraksi E (150 mg) dipisahkan. Dari hasil pemisahan kedua fraksi ini diperoleh senyawa yang sama yaitu 8-hidroksikalamenen (1) masing-masing sebanyak 43 mg dan 28 mg. Oleh karena itu maka total senyawa 8-hidroksikalamenen (1) yang dihasilkan yaitu sebanyak 103 mg. Skema pemisahan ditunjukkan pada Gambar III.1. III.3.2 Isolasi Metabolit Sekunder dari biji D. densiflorum Sebanyak 20 gram ekstrak aseton biji difraksinasi menggunakan teknik kromatografi, yaitu: kromatografi cair vakum (KCV) dengan komposisi eluen n-heksana dan etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 3:7; 2:8) sehingga diperoleh enam fraksi yaitu fraksi A (50 mg), fraksi B (0,13 g), fraksi C (0,18 g), fraksi D (0,69 g), fraksi E (0,75 g), dan fraksi F (0,63 g). Pemisahan fraksi C sebanyak 160 mg dipisahkan dengan KR menggunakan eluen n-heksana : CHCl 3 (8:2) sehingga diperoleh 3 fraksi, yaitu C.1-C-3. Fraksi C.2 merupakan senyawa murni yang diidentifikasi sebagai 4-isopropil-1,5-dimetil- 1,2,3,4-tetrahidronaftalen-6-ol (2) sebanyak 35 mg. Selanjutnya, pemisahan fraksi D sebanyak 500 mg dilakukan dengan KCV menggunakan eluen n-heksana dan etil asetat yang ditingkatkan kepolarannya menghasilkan 5 fraksi yaitu D.1 (20 mg), fraksi D.2 (113 mg), fraksi D.3 (56 mg), fraksi D.4 (34 mg), dan fraksi D.5 (48 mg). Fraksi D.2 sebanyak 110 mg selanjutnya dipisahkan menggunakan KR (eluen n-heksana - CHCl 3 (8:2)) sehingga diperoleh 4 fraksi. Fraksi D.2.2 merupakan 46 senyawa murni yang diidentifikasi sebagai 4-isopropil-1,5-dimetil-1,2,3,4- tetrahidronaftalen-6-ol (2) sebanyak 21 mg. Selanjutnya, fraksi E 210 mg dipisahkan dengan KR menggunakan eluen n-heksanaa : CHCl 3 (8:2). Dari hasil pemisahan kedua fraksi ini diperoleh senyawa yang sama yaitu senyawa 4-isopropil-1,5-dimetil-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-ol (2). Oleh sebanyak karena itu massa total senyawa (2) yaitu 136 mg.