28 4 Hasil dan Pembahasan 4.1 Isolasi Enzim Amilase Proses isolasi enzim dilakukan di dalam ruang 4 o C untuk mencegah rusaknya enzim selama proses isolasi. Isolasi enzim amilase menggunakan sampel ubi Cilembu mentah yang kering seberat 1050,0 g. Sampel ubi tersebut dipotong tipis sebelum dihomogenasi menggunakan blender dengan ditambahkan 0,1% β- merkaptoetanol dalam 0,05 M buffer Na-Asetat pH 4,8, dengan perbandingan ubi:larutan adalah 2:1. β-merkaptoetanol berfungsi untuk mencegah teroksidasinya senyawa polifenol oleh polifenol oksidase di dalam ubi. Larutan buffer yang digunakan adalah larutan yang dapat menjaga pH larutan tetap stabil sehingga tidak merusak enzim yang berada di dalamnya. Homogenat yang diperoleh kemudian disentrifugasi untuk memisahkan protein yang larut (pada supernatan) dan tidak larut (endapan). Supernatan yang diperoleh adalah 600 mL yang kemudian disebut Ekstrak Kasar Enzim (EKE). 4.2 Penambahan Substrat Pati Pada tahapan awal pemurnian, ekstrak kasar enzim yang diperoleh ditambahkan substrat dengan konsentrasi yang berlebih. Substrat yang dipakai adalah pati. Berdasarkan data penelitian sebelumnya yang menunjukan aktivitas pengikatan substrat oleh enzim, maka dilakukan penambahan pati dengan konsentrasi 1600 mg/mL. Konsentrasi tersebut diharapkan dapat mengikat keseluruhan enzim menghasilkan produk. Ekstrak kasar ditambahkan pati, kemudian disentrifugasi untuk memisahkan endapan dan supernatan. Endapan yang diperoleh adalah produk pengikatan enzim pada substrat, sedangkan supernatan adalah enzim lain 29 yang tidak mengikat pati. Supernatan (disebut supernatan 1) kemudian disimpan, sedangkan endapan dilarutkan kembali dengan 0,05 buffer Na-Asetat pH 4,8 untuk kemudian disentrifugasi kembali untuk memisahkan endapan dan supernatan. Endapan yang diperoleh (disebut endapan 2) adalah substrat yakni hidrolisis parsial dari pati, sedangkan supernatan yang diharapkan adalah hanya enzim amilase saja. Supernatan inilah yang kemudian disebut larutan enzim. Hasil dari setiap tahapan, dilakukan uji aktivitas untuk melihat aktivitas spesifik yang dimiliki. 4.3 Fraksinasi Amonium Sulfat Larutan enzim yang diperoleh, kemudian dilakukan tahapan pemisahan lebih lanjut yakni dengan cara pengendapan. Penambahan garam amonium sulfat dilakukan dengan tingkatan kejenuhan yang berbeda. Kondisi yang dipakai adalah 0-60% dan 60-80% yang kemudian masing-masing disebut F 60 dan F80.