32 Bab III Metode Penelitian Penelitian ini diawali dengan melakukan pengujian kadar kafein dan asam klorogenat serta pH hasil fermentasi kombucha coffee yang dilakukan pada 4 sumber kopi robusta yaitu Garut, Soreang, Aceh dan Ciwidey menggunakan analisis KCKT pada hari ke 0, 6, 12, 18, serta melakukan uji determinasi yang dilaksanakan di SITH ITB Bandung terhadap biji kopi hijau yang terbaik dari hasil pengujian. Proses optimasi fermentasi KC dilakukan dengan menggunakan 3 variabel fermentasi yaitu konsentrasi gula, suhu inkubasi dan lama inkubasi menggunakan metode RSM dengan menggunakan perangkat lunak minitab V.17, pada pelaksanaan optimasi ini diharapkan dapat diperoleh kadar kafein yang rendah serta kadar asam klorogenat tinggi. Penapisan fitokimia dilakukan terhadap simplisia biji kopi robusta maupun ekstrak kopi hijau yang telah di fermentasi dengan menggunakan kultur kombucha terhadap senyawa golongan alkaloid, flavonoid, saponin, steroid/triterpenoid, tanin dan kuinin, selanjutnya dilakukan karakterisasi simplisia. Pengujian toksisitas dengan menggunakan embrio zebrafish (Danio rerio) terhadap sediaan KC dengan menggunakan biji kopi hijau yang terpilih, pelaksanaan fermentasi disesuaikan dengan hasil optimasi dengan menggunakan RSM, dengan tujuan untuk mendapatkan nilai LC50. Penambatan molekul secara in silico dari kafein dan asam klorogenat terhadap enzim lipase pankreas pada reseptor 3PE6 dengan menggunakan perangkat lunak Autodock Tools (ADT) dengan menggunakan pembanding orlistat, selanjutnya dipilih konformasi ligan hasil penambatan yang memiliki energi ikatan yang paling rendah. Selanjutnya melakukan pengujian pre ADMET secara in silico guna mendapatkan informasi tentang farmakokinetika senyawa yang meliputi 33 absorpsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi serta uji toksisitas menggunakan parameter Kroes TTC decision tree. Selanjutnya, KC diuji pada tahap in vitro dan in vivo. Tahapan in vitro meliputi pengujian aktivitas inhibisi enzim lipase guna diperoleh IC50 dengan pembanding orlistat, sedangkan pada tahapan in vivo digunakan model zebrafish (Danio rerio). Hewan uji zebrafish diaklimatisasi (adaptasi), dikelompokkan dan diinduksi obesitas melalui pemberian pakan tinggi lemak, dan diuji dengan pemberian KC bersamaan dengan pakan ke dalam akuarium dengan pembanding orlistat. Parameter yang diamati pada hewan uji antara lain berat badan, IMT, glukosa darah dan trigliserida. Data yang diperoleh selanjutnya dianalisis kebermaknaan perbedaannya menggunakan Statistical Package fo The Social Science (SPSS) metode analisis One way ANOVA. Tahap terakhir dari penelitian ini adalah melaksanakan pengujian hedonik (uji kesukaan) terhadap hasil fermentasi yang diperoleh yaitu KC original serta produk hasil pengembangan KC original yang ditambahkan dengan buah-buahan antara lain, jeruk, nanas, anggur merah dan kiwi melalui fermentasi II yang dilaksanakan selama 3 hari. Uji kesukaan di lakukan dengan memberikan angket/kuisioner kepada responden guna menilai terhadap rasa, aroma dan warna dari sediaan KC. III.1 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah simplisia kopi hijau robusta (Coffea canephora L.) dari Aceh, Garut, Soreang dan Ciwidey Jawa Barat, kultur Kombucha (IndoKombucha), baku pembanding primer kafein dan asam klorogenat (Sigma- Aldrich), sukrosa, methanol, asetonitril, n-heksan, aseton, etil asetat, asam sulfat, orlistat (Xenical®), zebrafish wild type dari bogor, Tetramin (Tetra), kuning telur, minyak jagung, strip glukosa (Gluco Dr), Kit Trigliserida (Dialab), darah zebrafish, enzim lipase pankreas (Sigma-Aldrich) dan reagen kimia lain yang digunakan berderajat analisis. 34 Alat yang digunakan adalah alat penggiling kopi, neraca elektronik, labu Erlenmeyer, corong kaca, penangas listrik, kertas saring, kertas saring bebas abu, termometer, autoklaf, lampu bunsen, toples kaca, kain batis, benang kasur, inkubator, membran filter 0,45 µm, batang pengaduk, spatula, pipet, pinset, aluminium foil, tisu, kertas perkamen, gelas kimia, cawan porselen, cawan petri, syringe, chamber, vial, tabung reaksi, pipa kapiler, botol penyemprot, lemari pendingin, oven, labu ukur, tabung sentrifuga, sentrifuga, multiweel plate 24, pH meter (Mettler Toledo), dan Spektofotometer UV-Vis (Simadzu), KCKT (Simadzu), Minitab software V.17, aquarium, aerator, jangka sorong, mortir dan stamfer, glukometer (Autocheck), Lipid Pro, pH meter (Mettler Toledo), dan alat- alat gelas standar laboratorium farmasi. Perangkat lunak (software) yang digunakan adalah Discovery Studio 2016 Client ® , Chemdraw 15.0, Autodock Tools ® , Autodock4 ® , Toxtree ® dan aplikasi berbasis online Pre ADMET dan Ligand Scout. III.2 Penyiapan Bahan Uji III.2.1 Pengumpulan dan Penyiapan Simplisia Penyiapan bahan penelitian meliputi pengumpulan biji kopi hijau robusta kering, determinasi tanaman, dan penggilingan menjadi bongkahan yang lebih kecil dengan cara digiling. Biji kopi robusta diperoleh dari daerah Aceh, Garut, Soreang dan Ciwidey, Jawa Barat. Biji kopi hijau robusta yang digunakan harus dalam keadaan kering. Pengeringan terhadap biji kopi hijau robusta dilakukan menggunakan sinar matahari langsung. Determinasi tanaman dilakukan di Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, ITB, Bandung Pembuatan simplisia kopi robusta diawali dengan membersihkan kopi robusta yang telah dikeringkan dari kulit ari dan kulit tanduk, serta memisahkannya dari biji yang kotor. Selanjutnya biji kopi robusta pilihan digiling hingga menjadi bongkahan yang lebih kecil lalu disimpan dalam wadah tertutup. 35 III.2.2 Fermentasi Kombucha Coffee Biji kopi hijau robusta yang telah digiling dimasukkan ke dalam air mendidih dengan perbandingan 2,5 g biji kopi untuk 2 L air, selanjutnya ditambahkan 5; 7,5 dan 10 % (100, 150 dan 200 g) gula kemudian dilakukan pengadukan hingga homogen sampai semua sukrosa yang dimasukkan terlarut, didinginkan kemudian lakukan penyaringan. Setelah larutan dingin, lakukan penambahan cuka Kombucha sebanyak 10 % dan lakukan pengadukan hingga homogen. Setelah itu, masukkan larutan ke dalam toples kaca steril sebanyak 150 mL, selanjutnya tambahkan kultur kombucha (SCOBY) ke dalam toples berisi media sebanyak ± 15 g. Toples yang berisi inokulan kombucha selanjutnya ditutup dengan kain berpori (kain batis) steril dan ditempatkan dalam inkubator, tidak digoyang dan tidak dipindah-pindah. Metode fermentasi yang digunakan dalam kombucha coffee ini yaitu fermentasi batch. Dalam penelitian ini inkubasi dilakukan pada suhu ruang ± 25, 31 dan 37 °C, sedangkan lama inkubasi yaitu 0, 6, 12 dan 18 hari. Pemanenan hasil fermentasi KC dilakukan sesuai dengan lama inkubasi dari masing-masing sampel (Rahayu dan Rahayu, 2007; Jayabalan, dkk., 2007). III.2.3 Pemanenan Hasil Fermentasi Pemanenan dilakukan sesuai dengan lama fermentasi dari masing-masing sampel yang telah ditentukan sebelumnya yaitu 6, 12, 18 hari. Cairan hasil fermentasi KC selanjutnya dipisahkan dari kultur Kombucha dengan nata de coffee yang terbentuk di bagian permukaan cairan fermentasi. Cairan hasil fermentasi KC selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 40 menit guna mengendapkan serat-serat kultur kombucha dalam cairan hasil fermentasi yang masih tersisa. Filtrat KC kemudian diambil dan dimasukkan dalam botol terbuat dari kaca, steril lalu dilakukan penutupan dan disimpan dalam lemari es. III.2.4 Pengujian Hasil Fermentasi Analisis hasil fermentasi KC meliputi pengukuran pH, penetapan kadar kafein dan kadar asam klorogenat. Pengukuran pH dilakukan pada cairan hasil fermentasi dengan menggunakan pH meter. Dari hasil pemanenan KC dilakukan penetapan kadar kafein dengan mengambil aliquot sebanyak 10 mL, lalu dilakukan 36 penyaringan menggunakan kertas membran filter 0,45 µm. Selanjutnya sampel diuji menggunakan KCKT. Sistem KCKT yang digunakan pada penelitian ini yaitu menggunakan kolom C-18 dengan ukuran pori 5 µm dan detektor UV. Dalam analisis ini digunakan fase gerak metanol-air (7:3), kecepatan aliran 1,0 mL/menit serta panjang gelombang (λ) 273 nm (Gunawan, 2010). Sedangkan penetapan kadar asam klorogenat, digunakan kolom C-18 dengan ukuran pori 5 μm, fase gerak yang digunakan adalah methanol : aquabidest dengan asam asetat 1 % v/v (40:60), kecepatan aliran 1,0 mL/menit serta panjang gelombang (λ) 329 nm. III.3 Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak KC Tujuan dari pengujian karakterisasi simplisia dan ekstrak KC adalah untuk mengetahui spesifikasi dari tanaman uji serta untuk mengetahui kejelasan tanaman yang diteliti, hal ini dikarenakan lingkungan pertumbuhan dari tanaman dapat mempengaruhi kandungan kimia pada tanaman (Depkes RI, 1989). Metode pengujian karakterisasi simplisia dan ekstrak biji kopi hijau robusta yang digunakan mengacu pada prosedur yang terdapat dalam Farmakope Herbal Indonesia tahun 2008. III.3.1 Pengujian Kadar Air Penentuan kadar air dilakukan dengan cara destilasi, yaitu dengan cara sejumlah sampel uji yang ditimbang seksama yang diperkirakan mengandung 1 sampai 4 mL air dimasukkan ke dalam labu. Sejumlah 200 mL toluena jenuh air dimasukan ke dalam labu yang berisi sampel uji lalu didihkan sampai toluena mendidih. Setelah toluena mendidih dilakukan penyulingan dengan kecepatan kurang lebih 2 tetes per detik pada awal penyulingan dan dinaikan menjadi 4 tetes per detik. Penyulingan dihentikan saat seluruh air telah tersuling. Untuk mengantisipasi masih adanya air yang belum tersuling, maka dilakukan kembali penyulingan selama 5 menit. Setelah air dan toluena pada tabung memisah, dilakukan perhitungan kadar air dengan cara menghitung volume air terhadap volume total yang dinyatakan dalam % v/b. (Depkes RI, 2013). 37 Kadar air = Volume air Berat bahan x 100% (III.1) III.3.2 Pengujian Kadar Sari Larut Air Serbuk simplisia terlebih dahulu dikeringkan di udara.