27 Bab III Metodologi Penelitian Penelitian dimulai dengan mempelajari struktur primer rLSMT dan mencari keberadaan residu target dalam struktur tiga dimensi rLSMT pada database Protein Data Bank (PDB). Prediksi aksesibilitas pelarut atau nilai ASA dari residu target kemudian dilakukan dengan bantuan program ASAView dan NetSurfP. Kajian ini dilakukan di awal sebagai prediksi mungkin tidaknya reaksi konjugasi terjadi pada residu target dan sebagai dasar untuk menetapkan percobaan reaksi konjugasi yang dilakukan selanjutnya. Aksesibilitas residu sistein diuji juga dengan mereaksikannya menggunakan Ellman’s Reagent/DTNB dan mengukur absorbansinya pada spektrofotometer λ 412 nm. Dari hasil kajian aksesibilitas pelarut ditentukan residu potensial yang akan digunakan sebagai sisi aktif reaksi. Percobaan reaksi konjugasi kemudian dilakukan secara langsung maupun tidak langsung (tanpa/dengan bantuan senyawa crosslinker) disesuaikan dengan residu target mana yang akhirnya terpilih. Reaksi dilakukan dalam beberapa kondisi yang berbeda untuk menentukan pengaruh suhu dan jumlah perbandingan reaktan terhadap produk konjugat yang dihasilkan. Kondisi reaksi diusahakan berada dalam suasana yang mendukung kestabilan struktur rLSMT dan dalam pelarut berair. Dalam kasus dimana residu sistein terpilih sebagai target, reaksi konjugasi pertama- tama dicoba dilakukan secara langsung tanpa bantuan senyawa pemodifikasi. Hal ini dilakukan dengan mengatur pH pelarut untuk berada di suasana basa sehingga mendeprotonasi gugus sulfhidril membentuk ion tiolat untuk memungkinkan terbentuknya ikatan disulfida.