PENGEMBANGAN BIOKONJUGAT OBAT DENGAN LIGHT SUBUNIT MUSHROOM TYROSINASE (LSMT) UNTUK PENGHANTARAN OBAT SECARA ORAL TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat Untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh DIANA NIM: 20715019 (Program Studi Magister Farmasi) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG Jul 2017 i ABSTRAK PENGEMBANGAN BIOKONJUGAT OBAT DENGAN LIGHT SUBUNIT MUSHROOM TYROSINASE (LSMT) UNTUK PENGHANTARAN OBAT SECARA ORAL Oleh Diana NIM: 20715019 (Program Studi Magister Farmasi) Rute peroral untuk terapi sistemik memberikan kemudahan dan kenyamanan administrasi obat bagi pasien. Meski demikian sediaan peroral memberikan tantangan dari segi teknologi pembuatannya. Untuk memastikan senyawa aktif terhantar ke reseptornya, obat terlebih dahulu harus terabsorbsi masuk ke dalam pembuluh darah. Absorbsi obat menjadi terkendala jika permeabilitasnya rendah dan menyebabkan bioavailabilitasnya kecil. Penggunaan lektin untuk glikotargeting merupakan salah satu pendekatan untuk mengatasi permasalahan dalam penghantaran senyawa dengan permeabilitas rendah. Interaksi lektin dengan beberapa jenis gugus gula yang terdapat pada sel-sel di permukaan dinding saluran cerna dapat menyebabkan lektin untuk terserap. Saluran cerna dengan area yang luas dan terglikosilasi dapat ditargetkan untuk tujuan tersebut. LSMT (subunit rantai ringan dalam kompleks tetramer enzim tirosinase Agaricus bisporus) memiliki kemampuan untuk mengenali gugus gula secara spesifik, tidak toksik dan tidak imunogenik. Pembentukan biokonjugasi obat dengan LSMT dieksplorasi dalam penelitian ini untuk mengetahui kemampuan LSMT sebagai pembawa menggunakan kaptopril sebagai model obat. Penelitian diawali dengan mengetahui aksesibilitas residu sistein (kandidat penyedia ikatan konjugasi di permukaan protein) menggunakan program ASAView dan NetSurfP. Secara in vitro aksesibilitas sistein dilakukan dengan pengujian sulfhidril bebas menggunakan pereaksi DTNB. Biokonjugasi rLSMT-kaptopril akhirnya memungkinkan untuk dilakukan menggunakan residu lisin pada permukaan protein. Konjugat dibentuk dengan bantuan linker SMPT yang memanfaatkan ikatan disulfida yang dapat tereduksi untuk melepaskan obat terikatnya. Kondisi optimum yang saat ini ditemukan untuk pembentukan konjugat adalah pada suhu 4°C selama 24 jam pada tahap aktivasi protein dengan SMPT dan 48 jam pada tahap pengikatan kaptopril dengan perbandingan protein:SMPT = 1:10 dan protein teraktivasi:kaptopril = 1:100. Substitusi konjugasi yang diperoleh pada kondisi tersebut adalah antara 1- 2 mol kaptopril per mol LSMT. Konjugat yang terbentuk stabil pada larutan simulasi lambung dan usus. Selain itu uji permeabilitas awal secara in vitro menggunakan sel Caco2 dan secara ex vivo dengan metode non-everted gut sac menunjukan bahwa konjugat tidak mengurangi kemampuan LSMT untuk menembus dinding saluran cerna. Kata kunci: LSMT, biokonjugat, kaptopril, uji permeabilitas ii ABSTRACT DEVELOPMENT OF DRUG BIOCONJUGATE USING LIGHT SUBUNIT MUSHROOM TYROSINASE (LSMT) FOR ORAL DRUG DELIVERY By Diana NIM: 20715019 (Master of Pharmacy) Peroral routes for systemic therapy provides ease and convenience of drug administration for patients. However, preparation for peroral therapy provides challenges in terms of manufacturing technology. To ensure the active compound reaches its receptor, the drug must be absorbed into the blood vessels. Drug absorbtion becomes constrained if the permeability is low leading to limited bioavailability. The use of lectin for glycotargeting is an approach to overcome problems in the delivery of compounds with low permeability. Interaction between lectin with several types of oligosaccharides present in cells on the surface of gastrointestinal wall could caused the lectin to be absorbed. Vast glycosylated areas within gastrointestinal tracts can be targeted for this purpose. LSMT (light chain subunit in the tetramer complex of tyrosinase enzyme Agaricus bisporus) has the ability to recognize specific group of sugar moieties, non-toxic, and non- immunogenic. Formation of LSMT-drug bioconjugate was explored in this study to asses the ability of LSMT as a drug carrier using captopril as a drug model. The study begins with assessing solvent accessibility of cysteine residue (functional target candidate for bioconjugation) using ASAView and NetSurfP programs. In vitro accessibility of cystein was performed to determine free sulfhydryl using DTNB reagent. From the study, lysine is chosen as an active side of the reaction. Conjugate is formed with SMPT as a linker utilizing a reduced disulphide bond to release the bound drug. Optimum conditions currently found for conjugate formation is at 4 ° C for 24 hours for protein activation stage with SMPT and 48 hours for captopril binding stage with ratio of protein: SMPT = 1:10 and activated protein:captopril = 1:100. Conjugate substitution obtained under these conditions is between 1-2 mol of captopril per mole of LSMT. Conjugate formed was stable in simulated gastric and intestinal solutions. Furthermore, preliminary in vitro permeability study using Caco2 cells and ex vivo with non-everted gut sac method showed intact ability of LSMT to penetrate gastrointestinal wall. Keywords: LSMT, bioconjugate, captopril, permeability test iii LEMB AR P ENG ESAHAN PENGEMBANGAN BIOKONJUGAT OBAT DENGAN LIGHT SUBUNIT MUSHROOM TYROSINASE (LSMT) UNTUK PENGHANTARAN OBAT SECARA ORAL Oleh Diana NIM: 20715019 (Program Studi Magister Farmasi) Institut Teknologi Bandung Menyetujui Tim Pembimbing Tanggal ………… Pembimbing Pertama Dr. Heni Rachmawati Pembimbing Kedua Dr. Wangsa Tirta Ismaya iv PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HAKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kaidah ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Sitasi hasil penelitian Tesis ini dapat ditulis dalam bahasa Indonesia sebagai berikut: Diana. (2017): Pengembangan Biokonjugat Obat dengan Light Subunit Mushroom Tyrosinase (LSMT) untuk Penghantaran Obat secara Oral, Tesis Program Magister, Institut Teknologi Bandung. dan dalam Bahasa Inggris sebagai berikut: Diana. (2017): Development of Drug Bioconjugate using Light Subunit Mushroom Tyrosinase (LSMT) for Oral Drug Delivery, Master’s Program Thesis, Institut Teknologi Bandung. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Dekan Sekolah Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. v KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia-Nya sehingga buku tesis yang berjudul “Pengembangan Biokonjugat Obat dengan Light Subunit Mushroom Tyrosinase (LSMT) untuk Penghantaran Obat secara Oral” dapat diselesaikan dengan baik. Buku ini disusun sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan studi tingkat magister di Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung. Dalam penyusunan buku ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Dr Heni Rachmawati dan Dr. Wangsa Tirta Ismaya selaku pembimbing yang telah memberikan ilmu, bimbingan dan pengarahan sehingga penelitian ini dapat terselesaikan dengan baik. 2. Bapak Raymond R.