Path: TopS1-Final ProjectChemistry-FMIPA2015

KLONING GEN PROTEASE DARI Pseudomonas stutzeri BK-AB12 ISOLAT KAWAH LUMPUR BLEDUG KUWU

CLONING OF PROTEASE GENE FROM Pseudomonas stutzeri BK-AB12 BLEDUG KUWU MUD CRATER ISOLATE

Master Theses from JBPTITBPP / 2017-09-27 11:42:38
Oleh : WINDA RETNO GUMILAR (NIM : 20513079), S2 - Chemistry
Dibuat : 2015, dengan 7 file

Keyword : halofilik, Pseudomonas stutzeri BK-AB12, gen protease, kloning.

Protease adalah enzim yang bekerja sebagai katalis dalam reaksi pemutusan ikatan peptida pada molekul protein dengan cara hidrolisis. Enzim ini disebut juga enzim proteolitik. Protease banyak digunakan baik dalam industri pangan maupun non pangan. Di bidang industri pangan, enzim protease digunakan pada industri keju, bir, roti dan daging, sedangkan di bidang non pangan protease paling banyak digunakan di industri farmasi, fotografi, tekstil dan kulit. Kemajuan dalam bidang bioteknologi memungkinkan semakin meluasnya penggunaan protease sebagai katalis pada industri berbagai produk komersial. Salah satu aplikasinya yaitu pada industri detergen. Aplikasi yang luas ini membuat enzim protease diperlukan dalam jumlah melimpah. Salah satu cara mengantisipasi hal tersebut adalah dengan memproduksi enzim protease rekombinan. Penggunaan mikroorganisme sebagai sumber enzim protease memiliki beberapa keunggulan diantaranya dapat diproduksi dalam jumlah besar, produktivitasnya mudah ditingkatkan, harga lebih murah, mikroorganisme dapat ditumbuhkan dengan cepat, pertumbuhannya mudah diatur, enzim yang dihasilkan mudah diisolasi dan lebih ramah lingkungan. Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroorganisme dari kawah lumpur Bledug Kuwu, Jawa Tengah. Kawah lumpur Bledug Kuwu memiliki lingkungan yang unik seperti kadar garam yang tinggi, pH lumpur sekitar 7,5, salinitas air 8%, salinitas lumpur 5 - 6%. Mikroorganisme halofilik yang mampu beradaptasi di lingkungan seperti ini diperkirakan memiliki enzim-enzim yang potensial untuk dikembangkan, salah satunya adalah protease. Produksi protease dalam jumlah banyak dapat dilakukan dengan pendekatan yaitu mengisolasi gen pengkode protease dari mikroba potensial dan mengekspresikannya pada sel inang yang menghasilkan enzim halostabil rekombinan. Mikroorganisme rekombinan dapat memproduksi enzim halostabil dengan jumlah yang lebih besar dengan biaya yang lebih murah dibandingkan dengan mikroorganisme aslinya. Dalam penelitian ini dilakukan isolasi gen pengkode protease halofilik dari Pseudomonas stutzeri BK-AB12 isolat lokal.


Berdasarkan penelusuran literatur, telah dilaporkan Pseudomonas stutzeri memiliki gen protease subtilisin-like serin. Protease subtilisin-like serin telah dimanfaatkan dalam jumlah cukup banyak pada industri detergen. Dari hasil seleksi aktifitas proteolitik dengan pembentukan zona bening, diketahui Pseudomonas stutzeri BK-AB12 memiliki aktifitas enzim protease yang bersifat alkali. Pada penelitian ini gen pengkode protease diisolasi dari mikroorganisme halofilik isolat lokal, dengan metode polymerase chain reaction (PCR). Sepasang primer telah dirancang untuk mengamplifikasi gen protease utuh (XFPPst) dan (XRPPst) dengan urutan nukleotida masing-masing adalah 5’-CAA CGG CGT TGA CCC ATG ACG-3’ dan 5’-ATG GAG TGA CGT GGC CTA GCG-3’. Adanya pita berukuran sekitar 1800 pb pada gel agarosa hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen gen protease telah berhasil diamplifikasi. Produk PCR diligasikan ke vektor kloning pGEM-T easy menghasilkan plasmid rekombinan pGT-PPS. Seleksi plasmid rekombinan yang mengandung sisipan gen protease isolat lokal dipilih berdasarkan analisis pemotongan enzim restriksi EcoRI serta analisis PCR. Urutan nukleotida gen protease isolat lokal ditentukan menggunakan primer spesifik T7 promotor dan SP6. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa plasmid rekombinan mengandung gen protease berukuran 1800 pb dimana protease rekombinan yang dihasilkan memiliki 589 asam amino dan berat molekul 64,8 kDa. Analisis BLASTn menunjukkan bahwa gen protease dari isolat Pseudomonas stutzeri BK-AB12 memiliki homologi sekitar 99% dengan gen protease subtilisin like-serine Pseudomonas stutzeri A1501. Hasil analisis struktur tiga dimensi menggunakan metode pemodelan komparatif di server swiss-model struktur 3D menunjukkan bahwa protease yang dimodelkan mirip dengan extracellular serin protease dari Aeromonas sobria (PDB ID: 3HJR) sebesar 21,25%.

Deskripsi Alternatif :

Protease is an enzyme that act as catalyst in hydrolisis reaction of peptide bond protein molecules. It is also called as proteolytic enzyme. Protease is used mostly in food and non-food industries. In food industry, protease is used in cheese, beer, bread and meal industry while for non-food industry, it is mostly used in pharmacy, photography, textiles and leather industry. Advanced in biotechnology allows the utilization of protease as catalyst in industry to produced commercial product. One of them is in detergent industry. Protease is needed in large amount because of the increase demand for industry. One way to anticipate this by production of recombinant protease. Microorganism as source of protease have the some advantages compare to other source such as plant or animal. That is it can produced in large scale, its productivity easily to increase, low price, microorganism could be grown fast, its growth is easily to manage, enzyme easily to isolate and environment friendly. Microorganism used in this study derives from Bledug Kuwu Mud Crater, Central Java. Bledug Kuwu Mud Crater has unique environment like high salinity, pH of mud 7.5, 8% water salinity, 5 - 6% mud salinity. Halophilic microorganism that able to live at this environment was predicted having the potential enzymes to be developed. One of it is protease production of protease in large number could be performed by isolating the protease coding gene from potential microbes and expressing it in host cell that produce recombinant halostable enzymes. Recombinant microorganism could produce halostable enzyme in higher number by lower price if it is compare with the original microorganism. In this study, halophilic protease coding gene was isolated from local isolate Pseudomonas stutzeri BK-AB12. Based on literature study, it have been reported that Pseudomonas stutzeri has subtilisin-like serin protease gene. Subtilisin-like serin protease have been used in large number for detergent industry. From the result of proteolytic activity selection by formation of clear zone, it is known that local isolate Pseudomonas stutzeri BK-AB12 is an alkaline protease. In this study, the protease gene was isolated from local isolate halophilic microorganism with polymerase chain reaction (PCR) method. A pair of primers have been designed for amplification of whole protease gene XFPPst and XRPPst. Nucleotide sequence of forward primer are 5’-CAA CGG CGT TGA CCC ATG ACG-3’ and the sequence for the reverse primer are 5’-ATG GAG TGA CGT GGC CTA GCG-3’. DNA band which corresponde to fragment DNA with size of ± 1800 bp in agarose gel from electrophoresis analysis shows that protease gene has successfully amplified. The PCR product was ligated to cloning vector pGEM-T easy to give recombinant plasmid pGT-PPS. The recombinant plasmid which contain protease gene as insert was selected based on restriction analysis using EcoRI enzymes result and PCR analysis. The sequencing shows that recombinant plasmid contain protease gene with size 1800 bp. This gene encoding 589 amino acids and the protease has moleculer weight 64.8 kDa. BLAST analysis shows that protease gene from Pseudomonas stutzeri BK-AB12 isolate have 99% homology with the sequence of subtilisin like-serine protease Pseudomonas stutzeri A1501. Three dimensional structure was done by analysis method of comparative model in 3D structure swiss-model server. The analysis shows that structure of local isolate protease was similar to extracellular serine protease from Aeromonas sobria (PDB ID: 3HJR) by 21.25%.

Beri Komentar ?#(0) | Bookmark

PropertiNilai Properti
ID PublisherJBPTITBPP
OrganisasiS
Nama KontakUPT Perpustakaan ITB
AlamatJl. Ganesha 10
KotaBandung
DaerahJawa Barat
NegaraIndonesia
Telepon62-22-2509118, 2500089
Fax62-22-2500089
E-mail Administratordigilib@lib.itb.ac.id
E-mail CKOinfo@lib.itb.ac.id

Print ...

Kontributor...

  • Pembimbing : Dr.Rukman Hertadi; Dr. Made Puspasari W, M.Si, Editor: Alice Diniarti

File PDF...